超高效液相色谱-高分辨质谱测定10种植物内源激素

汪 瑾， 戴 琳， 王安琦， 卢亚萍*

(南京农业大学生命科学学院生命科学实验中心，江苏南京 210095)

植物激素是一类小分子化合物，参与植物的抗生物和非生物胁迫[1,2]。植物激素通常分为六大类，包括生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯和油菜素甾醇[3]。植物激素一般是极低浓度的植物内源物质，需要使用合适的方法来提取富集。用于分析植物激素的样品制备过程，包括采样、提取、纯化和浓缩，己成为快速分离以及痕量植物激素超灵敏分析的一个瓶颈[4]。

植物组织中植物激素的浓度和分布受温度、水情、空气湿度和光照强度等条件的影响[5]。因此，从植物中分离组织后，需要立即将收集的新鲜组织冻结在液氮中。然后选取合适的提取溶剂，理想的提取溶剂能够高效率地从样品中提取尽量多种类的植物激素。用于激素提取的溶剂包括甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇等[6]。样品前处理对实验结果产生很大的影响[7]。前处理技术，包括液-液萃取、固相萃取、分子印迹萃取、免疫亲和纯化等，现已被用于从粗提物中进一步纯化痕量植物激素[8]。检测技术一般包括生物测定法、免疫测定法、电分析法、色谱法以及质谱法[9-12]。色谱和质谱联用技术具有强分离能力，高灵敏性、选择性和准确性，已成为激素测定的强有力的工具。因此，液相色谱-四极杆飞行时间-质谱(LC-qTOF-MS)方法现已被用于测定痕量植物激素[13-15]。

本研究的目的在于建立一种利用LC-qTOF-MS测定植物中常见的内源激素(赤霉素、脱落酸、细胞分裂素、茉莉酸、水杨酸)的快速高效的方法，为激素的功能、相互作用等研究奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters G2-XS Q-TOF质谱仪(美国，Waters公司)，配有电喷雾(ESI)离子源；SpeedVac真空离心浓缩仪(美国，Thermo Fisher公司)。

10种植物激素标准品(纯度均>97%)：脱落酸(ABA)、赤霉酸(GA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MJ)、吲哚乙酸(IAA)、异戊烯腺嘌呤(IP)、玉米素(ZT)、玉米素核苷(ZR)、独脚金内酯(SL)，均购自上海源叶生物科技有限公司。将10种标准品用甲醇溶解，配制成浓度为1 mg/mL的母液，使用时稀释。甲醇、乙腈、丙酮、甲酸和NH4Ac为色谱纯，购自Merck Millipore公司；其他试剂为国产分析纯。

小麦、水稻、烟草、棉花、番茄、拟南芥来自江苏农科院种质资源与生物技术研究所，温室培养。

1.2 样品提取

取幼苗期的各种植物材料，用液氮研磨破碎后，称取100 mg，分别加入1 mL不同的样品提取液(1:66.7%异丙醇+1%甲酸；2:80%丙酮+1%甲酸；3:80%甲醇+1%甲酸；4:乙腈；5:乙腈+1%甲酸)，超声提取60 min，13 000 r/min离心10 min，收集上清液。沉淀中再加入0.5 mL样品提取液振荡10 min，13 000 r/min离心10 min，收集上清液。合并两次上清液，用真空离心浓缩仪挥干后，重新溶解于含0.1%甲酸甲醇中。

1.3 固相萃取

用1 mL 纯甲醇淋洗固相萃取小柱两次，再用1 mL 0.1%甲酸淋洗柱子两次。将10%甲醇(含0.1% 甲酸)溶解的样品加入到柱子里，用1 mL 0.1%甲酸淋洗柱子，最后用1 mL 80%甲醇(含0.1% 甲酸)洗脱两次。洗脱后的组分用真空离心浓缩仪挥干，复溶于0.2 mL 80%甲醇(含0.1% 甲酸)中，待测。

1.4 液相色谱-质谱检测条件

色谱条件：色谱柱：UPLC BEH C18柱(100×2.1 mm，1.7 μm；美国Waters公司)；流动相A为0.1%甲酸+2 mmol/L NH4Ac(正离子)，或2 mmol/L NH4Ac(负离子)；流动相B为甲醇。洗脱条件如下：0～11 min，5%～95%B；95%B淋洗柱子，然后恢复到起始组分5%B。进样量2 μL；柱温35 ℃。

质谱条件：毛细管电压：3.0 kV；锥孔电压：40 V；源温度：120 ℃；脱溶剂温度：400 ℃；碰撞能量：10～50 eV；比扫描范围：m/z50～1 000；亮氨酸脑啡肽(LE)用于质量校正。

1.5 数据分析

质谱数据采集和分析使用 Waters Masslynx 4.1软件。实验数据为三次重复平均值，表示为平均数值±标准偏差(SD)。采用StudentT检验对实验数据进行比较，当p<0.05时，认为有显著性差异；当p<0.01时，认为差异极为显著；当p>0.05时认为没有显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择及优化

色谱柱及流动相的选择会对化合物的分离度和峰形产生重要的影响[19，20]。液相色谱-质谱分析中，有机流动相一般采用乙腈或甲醇，同时也会添加一定量的酸和盐以提高离子化效率、改善峰形。本研究比较了乙腈和甲醇的分离效果，发现两者没有显著差异，于是选择了毒性较小、成本较低的甲醇作为有机相。同时在正离子模式下，流动相A(ddH2O)中添加了0.1% 的甲酸及2 mmol/L的NH4Ac，负离子模式下流动相A中添加了2 mmol/L的NH4Ac，达到了良好的离子化效率和分离效果。

2.2 10种常见植物内源激素的定性分析

在MS/MS采集模式下，对10种化合物进行一级全扫描和二级碎片检测。正离子模式下，IAA、IP、ZR、ZT、SL和MJ有较好的响应度，而ABA、GA3、JA和SA在负离子模式下响应度较好，提取离子色谱图如图1、图2。在MS/MS 模式下，以[M+H]+或[M-H]-离子为母离子得到二级碎片离子的质谱信息列于表1。选择丰度相对较高的子离子作为特征碎片离子，各物质的一级、二级色谱图、质谱图及结构信息如图3、图4。

2.3 10种植物内源激素的定量测定

将10种激素标准品溶液稀释为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，对每个梯度的样品进行质谱测定，采集模式为MS、MS/MS或MRM。采用不同的采集模式时，各种激素的响应度不同，其中MS的响应度最高，而MS/MS及MRM模式下的响应度会降低1～2个数量级。因此采用MS模式对各种激素进行定量测定，制作标准曲线，确定其检测限(LOD)和定量限(LOQ)，测定结果列于表2。所有的激素样品在稀释浓度范围内具有较好的线性关系，相关系数R2达到0.99以上。每种样品检测限和定量限相差很大，其中IP，ZR定量限为0.1 ng/mL，是所测激素中质谱响应度最高的。

图1 正离子模式下6种植物激素的提取离子色谱图Fig.1 Extraction ion chromatograms of six plant hormones in positive ion mode

图2 负离子模式下4种植物激素的提取离子色谱图Fig.2 Extraction ion chromatograms of four plant hormones in negative ion mode

图3 正离子模式下6种植物激素的一级、二级质谱图及碎片结构信息Fig.3 MS,MS/MS and structure elucidation of six plant hormones in positive ion mode

表1 10种植物激素的质谱信息

图4 负离子模式下4种植物激素的一级、二级质谱图及碎片结构信息Fig.4 MS,MS/MS and structure elucidation of four plant hormones in negative ion mode

2.4 10种植物激素添加回收实验

选用目标植物激素含量低于检测限的植物样品作为空白基质，分别加入3个浓度(10、50、200 ng/mL) 的激素标品混合物，通过Waters HLB固相萃取小柱回收后，测定回收前后的质谱响应值，计算测定浓度及回收率，测定结果见表3。对于浓度为200、50 ng/mL激素样品，回收率可达到90%以上；而对于浓度为10 ng/mL 的样品，回收率偏低。其中SL的回收率最低，为77.8%，ZT的回收率最高，为92.6%。

表3 10种植物激素的添加回收率和相对标准偏差(n=3)

2.5 不同的样品提取液和溶剂对激素提取效率的影响

选取5种试剂从烟草幼苗中提取激素。5种提取液分别是：(1)66.7%异丙醇+1%甲酸；(2)80%丙酮+1%甲酸；(3)80%甲醇+1%甲酸；(4)乙腈；(5)乙腈+1%甲酸。不同提取液的提取效果如图5。丙酮作为提取剂，提取液颜色很深，说明其中溶解了很多的叶绿素，会对后续的样品前处理和样品测定造成较大影响。异丙醇和乙腈的提取效果相对更好，而乙腈提取时IP的响应值明显优于异丙醇。加入1%甲酸对乙腈的提取效果有更好的提高作用。对于烟草样品中含量较高的成分IP、 ZR、 ZT、 SA，使用乙腈+1%甲酸作为提取液，提取效果明显优于其余几种提取液。

为了考察不同的溶剂复溶对于激素溶解和测定的影响，将提取后的激素初提液旋转挥干后溶于20%～100%的甲醇中，通过LC-MS测定其质谱响应值，结果见表4。对于IP，ZT和SA，在80%甲醇中检测信号最强，而ZR在100%甲醇中检测到的信号最强。100%甲醇溶解时溶液中叶绿素含量较高。综合考虑，选用80%的甲醇作为溶剂复溶激素提取物。

在提取过程中，比较了振荡提取和超声提取的提取效果，以及提取时间对提取效果的影响。结果发现，超声提取的植物激素的量大于振荡提取，并且提取60 min可达最佳效果。在对样品粗提液进行浓缩干燥时，我们比较了使用氮吹仪和离心浓缩仪的效果。两种仪器的处理对于植物激素的影响程度没有显著区别，因此选择速度更快的真空离心浓缩仪作为处理仪器。

实验还比较了汉邦C18柱、安普C18柱和MAX(阴离子交换吸附柱)的纯化效果，两种C18柱的回收效果略低于Oasis HLB小柱，而MAX柱在本实验中对于酸性化合物的回收效率并未显著高于HLB小柱，因此选用HLB柱作为标准品和植物样品的萃取柱。

2.6 植物材料中激素的测定

选取几种植物材料幼苗，按优化的提取及测定方法，通过高分辨率飞行时间-质谱，采用一级全扫描的方式测定其质谱响应值，并根据标准曲线计算各种激素的含量。从100 mg水稻、小麦、烟草、棉花、番茄、拟南芥幼苗中，检测到了IAA、IP、ZR、ZT、ABA、GA3、JA、SA(表5)，而SL和MJ含量低于定量限，未检出。

表5 几种植物材料中植物激素的定量结果(ng/g FW)

3 结论

本研究优化了从植物样品中提取和纯化激素，并利用超高效液相色谱-高分辨率质谱进行定性定量测定。10种激素在质谱上均有良好的响应，检测限为0.05～5 ng/mL，定量限为0.1～10 ng/mL。采用含1%甲酸的乙腈超声浸提小麦、水稻、烟草、棉花、番茄和拟南芥幼苗粉末，然后用固相萃取小柱进行样品前处理，最后用80%甲醇复溶，采用质谱全扫描模式测定各种植物激素的含量。本实验建立了简便快速提取和测定植物激素的分析方法。