呼吸道合胞病毒下呼吸道感染病儿外周血微小RNA-145表达与T淋巴细胞亚群的关系

吴振奎，钟丽花，林则彬，王家文

作者单位：1海南现代妇女儿童医院儿科，海南 海口571100；

2海南省儿童医院儿科，海南 海口571100

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是婴幼儿下呼吸道感染的主要病原体之一。临床表现为高热、呼吸困难等症状，可引起肺炎、毛细支气管炎，尤其是肺炎，严重影响婴幼儿身心健康成长。因此，探讨与RSV 下呼吸道感染肺炎发病相关因子具有重要临床意义。T 淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8、CD4/CD8等在发挥免疫功能及维持免疫平衡中起关键作用，研究发现T 淋巴细胞免疫功能失调参与RSV 下呼吸道感染肺炎病情进展。而微小RNA-145（MicroRNA-145，mir-145）是目前呼吸系统疾病中研究较多的微小RNA（MicroRNA，miRNA）家族成员之一，其水平异常变化在机体免疫反应中发挥至关重要的作用，参与多种疾病发生、发展。但mir-145 与RSV 下呼吸道感染肺炎发病及其T淋巴细胞亚群的关系尚不十分明确。鉴于此，本研究通过检测RSV 下呼吸道感染肺炎病儿外周血血浆中mir-145表达，分析其与外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值关系，以期为临床治疗RSV 下呼吸道感染肺炎提供新思路。结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年1月至2018 年12 月海南现代妇女儿童医院儿科收治的RSV 下呼吸道感染肺炎病儿126 例作为RSV 肺炎组。入选标准：①均符合RSV 下呼吸道感染肺炎相关诊断标准；②RSV 检测阳性；③均为急性发病；④临床资料完整齐全。排除标准：①合并支气管哮喘、肺结核等其他呼吸系统疾病；②入组前接受糖皮质激素类或抗菌药物治疗；③伴有喉软骨及肺发育不良；④合并先天性心脏病。RSV肺炎组病儿男性69例、女性57例，年龄（9.87±3.28）月，年龄范围为30 d至15个月。另选取同期在海南现代妇女儿童医院进行体检的健康儿童130例作为健康对照组，心肺无异常，且无呼吸道感染病史，其中男性71 例、女性59 例，年龄（10.24±3.40）月，年龄范围为30 d 至15 月。RSV 肺炎组病儿根据病情严重程度分为轻度组（n=54）、重度组（n=72），其中轻度组男性30 例、女性24 例，年龄（9.68±3.17）月，年龄范围为30 d 至14 月；重度组男性39 例、女性33 例，年龄（9.94±3.20）月，年龄范围为30 d 至15 月。并依据重度组病儿是否给予机械通气分为非机械通气组（n = 38）、机械通气组（n=34），其中非机械通气组男性21 例、女性17 例，年龄（9.73±3.22）月，年龄范围为30 d～15 月；机械通气组男性18 例、女性16 例，年龄（9.50±3.14）月，年龄范围为30 d至15月。病儿近亲属均签署《知情同意书》。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。同时，健康对照组与RSV 肺炎组、轻度组与重度组、非机械通气组与机械通气组基本资料相比，均差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表1～3。

表1 健康对照组与呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎组基线资料比较

表2 呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎轻度组与重度组基线资料比较

1.2 方法

1.2.1 标本收集 分别抽取健康对照组和RSV 肺炎组病儿外周静脉血4 mL。取2 mL 使用乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K）抗凝，室温静置30 min 后离心（3 000 r/min）10 min，分离获取血浆，并储存于-80 ℃低温环境中，用于检测血浆mir-145 表达水平。另2 mL EDTA-K抗凝后，使用Ficoll-Hypaque分离液（购自无锡华精生物科技有限公司）分离提取PBMC，用于检测T 淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值。

表3 重度呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎非机械通气组与机械通气组基线资料比较

1.2.2

血浆mir-145 表达水平检测 利用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）检测血浆mir-145表达水平。按照Trizol试剂盒（购自沈阳万类生物科技有限公司）说明书提取血浆中总RNA，并依据PrimeScriptRT试剂盒（购自杭州主诺生物技术有限公司）中方法合成cDNA 链。以U6 为mir-145内参进行扩增，引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。mir-145正向引物为5′-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3′，反向引物为5′-GCAAATCCAGCTGTGAAACCA-3′；内参U6正向引物为5′-GTGGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物为5′-GTAACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。所有反应均重复3次，完成后获得Ct平均值，并用2计算血浆mir-145相对表达量。

1.2.3

PBMC 中T 淋巴细胞亚群检测 使用BD FACSCalibur型流式细胞仪及配套试剂盒（购自北京德利卡生物技术有限公司）检测PBMC 中T 淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8水平，并用MRFlow 流式细胞分析软件自动行CD3、CD4、CD8绝对计数，同时计算CD4/CD8值。

1.3 统计学方法

运用SPSS 20.0 软件对数据进行统计分析。计数资料采用率（%）进行统计描述，行χ检验；计量资料（血浆mir-145 表达及PBMC 中CD3水平等）均符合正态分布和方差齐性检验，采用x ± s 进行统计描述，行t 检验。采用Pearson 检验分析RSV 肺炎病儿血浆mir-145 表达与PBMC 中T淋巴细胞亚群水平的相关关系。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康对照组与RSV 肺炎组血浆mir

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145 表达及PBMC 中T 淋巴细胞亚群水平比较

RSV 肺炎组病儿血浆mir-145 表达及PBMC 中CD8水平均明显高于健康对照组（P ＜0.05），PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均显著低于健康对照组（P ＜0.05）。见表4。

2.2 不同程度RSV 肺炎病儿血浆mir

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145 表达及PBMC 中T 淋巴细胞亚群水平比较

重度组病儿血浆mir-145 表达及PBMC 中CD8水平均显著高于轻度组病儿（P ＜0.05），PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均明显低于轻度组病儿（P ＜0.05）。见表5。

2.3 重度RSV肺炎非机械通气组与机械通气组病儿血浆mir-145 表达及PBMC 中T 淋巴细胞亚群水平比较

重度RSV肺炎机械通气组病儿血浆mir-145表达及PBMC中CD8水平均明显高于非机械通气组病儿（P ＜0.05），PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均显著低于非机械通气组病儿（P ＜0.05）。见表6。

表4 健康对照组与呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎组血浆微小RNA-145（mir-145）表达及外周血单个核细胞（PBMC）中T淋巴细胞亚群水平比较/x ± s

表5 不同程度呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎病儿血浆微小RNA-145（mir-145）表达及外周血单个核细胞（PBMC）中T淋巴细胞亚群水平比较/x ± s

表6 重度呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎非机械通气组与机械通气组病儿血浆微小RNA-145（mir-145）表达及外周血单个核细胞（PBMC）中T淋巴细胞亚群水平比较/x ± s

2.4 RSV 肺炎病儿血浆mir

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145 表达与PBMC 中T 淋巴细胞亚群水平的相关性

RSV 肺炎病儿血浆mir-145 表达与PBMC 中CD3水平呈负相关（r = -0.594，P ＜0.05），与PBMC 中CD4水平呈负相关（r-0.620，P ＜0.05），与PBMC 中CD8水平呈正相关（r0.657，P ＜0.05），与CD4/CD8值呈负相关（r = -0.633，P ＜0.05）。见图1。

3 讨论

近年来，因RSV 引起下呼吸道感染肺炎住院的婴幼儿越来越多，若治疗不及时，易发展为重症肺炎，甚至可导致心力衰竭，危及病儿生命安全。因此寻找用于早期判断RSV 下呼吸道感染肺炎病情程度的生物标记物至关重要。本研究选取外周血血浆中mir-145作为观察项目，探讨其与T 淋巴细胞亚群的关系，以期为早期防治RSV 下呼吸道感染肺炎提供有力依据。

图1 呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎病儿血浆微小RNA-145（mir-145）表达与外周血单个核细胞（PBMC）中T淋巴细胞亚群水平的相关性

miRNA是一类内源性非编码RNA分子，可通过降解靶基因mRNA 或抑制其翻译，参与免疫反应调控等一系列过程。研究证实，miRNA 在多种呼吸系统疾病中起重要作用，如mir-145。mir-145是一种高度保守的miRNA，定位于人染色体5q32-33，其在T 淋巴细胞生成、发育中起重要调控作用。Qiu等研究报道，哮喘发病与淋巴细胞中辅助性T 细胞1（T helper cell 1，Th1）/辅助性T 细胞2（T helper cell 2，Th2）的平衡密切相关。且Fan 等研究发现，外周血mir-145 表达水平可通过靶向哮喘患者Runt 相关转录因子3（Runt-related transcription factor 3，Runx3）调节Th1/Th2 平衡，可作为诊断和治疗哮喘的生物标志物。T 淋巴细胞是维持机体正常免疫功能的重要亚群，可分为CD4、CD8两大亚群，CD4细胞活化后主要分为Th1、Th2 两种类型，而Th1/Th2 平衡失调在肺炎发病过程中具有重要意义。CD3可用于评估细胞免疫的总体水平，CD4/CD8值可反映机体免疫稳态情况。正常情况下，T 淋巴细胞亚群间相互作用，稳定调节机体免疫功能。徐畅等研究发现，外周血CD3、CD4、CD8 水平及CD4/CD8 值变化与哮喘病儿过敏原类型有关，在哮喘发病过程中起重要作用。游正铭研究报道，监测重症肺炎患者淋巴细胞亚群（CD3等）水平，有利于临床治疗重症肺炎和判断预后。此外，梁导艳等研究发现，支原体肺炎病儿CD3水平、CD4/CD8 值远低于健康对照组，可作为反映免疫功能状态的有效指标。

本研究中，RSV肺炎组病儿血浆mir-145表达及PBMC 中CD8水平均远高于健康对照组，PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均远低于健康对照组，与梁导艳等研究结果类似，提示外周血血浆中mir-145 表达及PBMC 中T 淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8水平、CD4/CD8值异常可能与RSV 下呼吸道感染肺炎发病有关。进一步研究发现，重度组病儿血浆mir-145 表达及PBMC 中CD8水平均远高于轻度组病儿，PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均远低于轻度组病儿，提示外周血血浆中mir-145 表达异常升高及T 淋巴细胞亚群异常可能参与RSV 下呼吸道感染肺炎病儿病情进展。本研究还发现，重度RSV 肺炎机械通气组病儿血浆mir-145 表达及PBMC 中CD8水平均远高于非机械通气组病儿，PBMC 中CD3、CD4水平及CD4/CD8值均远低于非机械通气组病儿，提示临床通过监测上述参数变化，可能有利于评估RSV 下呼吸道感染肺炎病儿病情严重程度，对早期治疗RSV 下呼吸道感染肺炎具有临床意义。此外，本研究Pearson检验分析发 现，RSV 肺 炎病 儿血 浆mir-145 表 达与PBMC 中CD3水平呈负相关，与PBMC 中CD4水平呈负相关，与PBMC 中CD8水平呈正相关，与CD4/CD8值呈负相关，推测外周血血浆中mir-145表达参与RSV下呼吸道感染肺炎发生、发展，可能与PBMC 中T 淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8水平及CD4/CD8值异常变化有关。

综上所述，外周血血浆中mir-145 表达水平在RSV 下呼吸道感染肺炎病儿中明显升高，其水平变化可能与T 淋巴细胞亚群CD8水平异常升高，CD3、CD4水平及CD4/CD8值异常降低有关，提示监测上述参数变化可能有助于早期防治RSV 下呼吸道感染肺炎。本研究仅初步探讨RSV 下呼吸道感染肺炎病儿外周血血浆中mir-145 表达与T 淋巴细胞亚群的关系，下一步应增加样本继续进行研究。