尿液及血清骨膜蛋白的检测对早期诊断儿童紫癜性肾炎的价值

王丽，周小勤，涂丹娜，黄方，陈霞

作者单位：1湖北省妇幼保健院儿内科，湖北 武汉430070；

2湖北文理学院附属医院、襄阳市中心医院儿科，湖北 襄阳441021

过敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）是发生在儿童中一种免疫球蛋白A（IgA）介导的系统性小血管炎，IgA 抗体在血管壁上的沉积会导致皮肤、关节、肠和肾脏的症状。紫癜性肾炎（Henoch-Schonlein purpura nephritis，HSPN）是HSP 最严重的并发症之一，通常定义为HSP伴有血尿和/或蛋白尿的肾脏受累，并且通常决定HSP病人的预后，相关研究结果显示HSPN 在儿童继发性肾小球疾病中占第一位。骨膜蛋白是一种细胞外基质蛋白，是由成骨细胞及其前体细胞分泌的，多在牙周韧带和骨膜中出现，与皮肤修复、牙齿与骨骼生长有关。近年研究显示，骨膜蛋白在一些肾病中有表达，其在HSPN 中的作用研究较少。本研究通过检测HSPN 病儿尿液与血清中骨膜蛋白的表达水平，探讨骨膜蛋白的检测对早期诊断儿童HSPN的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012 年6 月至2018 年6 月在湖北省妇幼保健院就诊的HSPN 病儿35 例为HSPN组，其中男性19 例，女性16 例，年龄（8.62±1.68）岁，年龄范围为6～11 岁。纳入的HSPN 病儿均符合儿童HSPN 诊治循证指南（2016 年由中华医学会儿科学分会肾脏学组制定）。选取同期在湖北省妇幼保健院门诊健康体检的35例儿童为健康对照组，其中男性19 例，女性16 例，年龄（8.38±1.72）岁，年龄范围为6～11 岁。纳入标准：①近1 个月未服用存在肾毒性药物；②既往无泌尿系统及肾脏疾病，尿检筛查正常，家族无肾脏遗传性疾病。两组年龄比较，差异无统计学意义（t=1.629，P=0.072），具有可比性。病儿近亲属对研究方案签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 样本采集

HSPN 组病儿在就诊第二天早晨采集尿液和血液样本，健康对照组儿童于体检时留取尿液和血液样本。具体方法：在清洗外阴后采集中断尿5 mL 作为尿液样本，采集外周静脉血3 mL 作为血液样本，并在4 ℃下3 000 r/min 离心10 min。分别吸取上层尿液及上层血清至无菌干燥的EP 管中，将所得样本分别编号后置于-80 ℃冰箱中冻存备用。

1.3 骨膜蛋白的测定

1.3.1

实验材料与器材 人骨膜蛋白试剂盒（购自江苏酶标生物科技有限公司），酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司），振荡器（汇诚生物科技有限公司）。

1.3.2

实验方法 采用ELISA法检测血清和尿的样品中骨膜蛋白的相对表达水平，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。（1）实验前准备：试剂盒、血清和尿的样品均置于室温中复温，以备后续实验使用。（2）实验过程：①将标准品倍比稀释后绘制标准曲线。将50 μL标准品和待测样品分别加入反应孔中，盖上膜盖后轻轻振荡，37 ℃孵育30 min。②弃去孔内液体，加入配制好的洗涤液，洗涤5次并拍干。③除空白孔之外的反应孔中加入酶标试剂50 μL。孵育、洗涤同前。④每孔加入A、B 显色剂各50 μL，轻轻混匀，37 ℃孵育10 min，避免光照。迅速加入50 μL 终止液。⑤在450 nm 波长处测定各孔的OD 值。（3）计算方法：根据样品的OD 值在标准曲线中查出相应的浓度，再乘以稀释的倍数，计算出样品中人骨膜蛋白的实际浓度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。计量资料用x ± s 表示，比较采用t 检验，采用Medcalc 软件绘制受试者工作特征曲线（ROC 曲线）并进行分析，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组尿液及血清骨膜蛋白表达水平比较

两组尿液及血清中骨膜蛋白表达水平均差异有统计学意义（P ＜0.01）。见表1。

表1 健康对照组与紫癜性肾炎（HSPN）组尿液及血清中骨膜蛋白表达水平比较/（pg/mL，±s）

2.2 尿液及血清骨膜蛋白ROC 曲线

为了评价尿液及血清骨膜蛋白对儿童HSPN 早期诊断的价值，本研究通过绘制ROC 曲线进行分析，结果显示曲线下面积（AUC）分别为0.838 与0.778，病儿尿液中骨膜蛋白表达水平的灵敏度和特异度相对较好，尿液及血清骨膜蛋白对儿童HSPN 早期诊断的价值差异有统计学意义（Z=6.528，P ＜0.01）。见图1和表2。

图1 尿液及血清骨膜蛋白ROC曲线

表2 尿液及血清骨膜蛋白对儿童紫癜性肾炎（HSPN）早期诊断的ROC分析

3 讨论

HSP是一种小血管、白细胞碎裂性血管炎，可在不同器官中引起多种症状。HSP是儿童时期最常见的系统性血管炎之一，男孩的发病率略高于女孩，有研究显示17 岁以下儿童HSP 患病率为6～24/10万，而HSPN 通常为HSP 伴有血尿和/或蛋白尿的肾脏受累。大约20%的HSPN 病人发展为肾病或肾病综合征，基于大量临床和实验研究的结果显示，在HSPN 肾小球中肾外来源的含IgA 免疫复合物的肾小球沉积可导致肾脏炎症改变，因此，HSPN 可被视为免疫复合物肾炎。骨膜蛋白作为由成骨细胞及其前体细胞分泌的一种细胞外基质蛋白，多在牙周韧带和骨膜中出现，并参与皮肤修复、牙齿与骨骼生长。近年来，有关骨膜蛋白在肾脏中的作用得到了研究人员的重视，Hwang等的研究结果显示，在IgA 肾病肾纤维化病人尿中骨膜蛋白可能是早期生物标志物。有研究显示在狼疮性肾炎病人中，骨膜蛋白主要表达于肾小球周围发生纤维化的部位与硬化的肾小球中。在糖尿病肾病病人的肾小管和肾小球中骨膜蛋白均有表达，结果显示肾功能与骨膜蛋白表达量相关。本研究结果显示：HSPN组尿液及血清中骨膜蛋白的表达量均高于健康对照组，推测在HSPN 的发生发展过程中骨膜蛋白可能参与其中，当机体发生炎症免疫反应时，刺激纤维化的肾组织及肾血管平滑肌细胞产生骨膜蛋白并释放入血；而过敏性紫癜病儿发生肾损伤时，受损的肾组织被诱导表达骨膜蛋白，骨膜蛋白通过肾小管上皮细胞分泌或表达骨膜蛋白的细胞退化脱落至尿液中导致尿骨膜蛋白增加。本研究通过绘制ROC曲线进行分析，曲线下面积（AUC）分别为0.838与0.778，尿液及血清骨膜蛋白对儿童HSPN 早期诊断的价值差异有统计学意义，病儿尿液中骨膜蛋白表达水平的灵敏度和特异度相对较好，提示我们在HSPN的相关研究中尿骨膜蛋白可作为敏感指标。