葛根素基于内质网蛋白核心/信号分子/C/EBP同源蛋白通路对脂多糖诱导成骨细胞骨保护素及核因子-κB受体mRNA表达的影响

王海珍，王丽娟，贠云飞

作者单位：1唐山市协和医院中医科，河北 唐山063000；2迁西县人民医院骨科，河北 唐山064300

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性厌氧菌细胞壁的主要成分，可引发机体炎症；可打破骨吸收和骨沉积平衡状态，导致骨丧失，最终引起牙槽骨病理性吸收，在牙周炎、根尖周炎等牙周病致病过程中发挥重要的调控作用。骨组织的代谢平衡是维持骨正常功能的关键，其通过成骨细胞和破骨细胞共同完成。LPS 可抑制成骨细胞骨保护素（osteoprotegerin，OPG）表达，促进核因子-κB 受体（receptoractivatorofnuclearfactor- κBligand，RANKL）表达，进而抑制成骨分化，减少骨形成；还可促进破骨细胞形成，增强骨吸收，最终导致骨代谢平衡向骨吸收偏移，影响骨组织正常功能。葛根素可使成骨细胞OPG 表达升高，RANKL 表达降低，促进成骨前体细胞的成骨分化，抑制破骨细胞形成及其活性，最终维持正常的骨代谢平衡，有效地预防去卵巢小鼠的骨质流失，促进子宫内胎鼠的骨形成，因此葛根素可能上调OPG mRNA 水平，下调RANKL mRNA 水平，减轻LPS 对成骨前体细胞成骨分化的抑制作用。内质网蛋白核心/信号分子/C/EBP 同源蛋白（GRP78/PERK/CHOP）是调节内质网应激的关键信号通路，在LPS 诱导的机体炎症反应中发挥重要作用，抑制其表达，可抑制炎症反应，降低破骨细胞生成及其活性，抑制成骨细胞凋亡，增强成骨活性，而葛根素可以抑制GRP78、PERK 表达，减轻内质网应激反应，因而推测下调GRP78/PERK/CHOP 通路可能是葛根素对抗LPS 对成骨前体细胞成骨分化抑制作用的作用机制，本文自2018年3 月至2019 年3 月通过以LPS 处理体外培养的MC3T3-E1 细胞，探讨基于GRP78/PERK/CHOP 通路研究葛根素对LPS 诱导成骨细胞OPG 和RANKL mRNA表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1 购自上海匹拓生物科技有限公司（货号PT1485）；OPG、RANKL、成骨相关基因（Runx2）、骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（OCN）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；葛根素购自上海恒斐生物科技有限公司（货号P9050）；4-苯基丁酸钠盐（4-Phenylbutyric acid，4-PBA）购自北京谨明生物科技有限公司（货号：P10083）；DMEM 高糖培养基购自上海微科生物技术有限公司（货号L0104-100）；LPS、胎牛血清（FBS）、PBS 缓冲液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、100×青链霉素混合液、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购自Solarbio 公 司（货 号 分 别 为L8880、11011-8611、P1022、T1300、P1400、P1200-50T）；成骨诱导培养基购自百致生物医药科技（上海）有限公司（货号biosmedi-DF-8001）；茜素红染色液购自上海联硕生物科技有限公司（货号N/A-899）；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒购自日本Takara 公司（货号分别为9108、RR037Q/A/B、639519）；兔源GAPDH、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）及内质网应激蛋白（CHOP）一抗、羊抗兔二抗购自美国Abcam 公司（货号分别为 ab181602、 ab21685、 ab229912、 ab179823、ab150077）；碱性磷酸酶检测试剂盒、RIPA 裂解液、BCA 试剂盒购自上海碧云天公司（货号分别为P0321、P0013K、P0011）等。

3900 型高通量DNA 合成仪购自美国应用生物系统公司；CFX96 Touch Deep Well 荧光定量PCR 仪购自美国Bio-Rad 公司；Elx800 酶标仪、1659001 蛋白电泳仪、Trans-Blot SD 半干转膜仪购自美国Bio-Rad 公司；CKX41-F32F 光学显微镜购自日本Olympus 公司；Centrifuge 5424R 低温高速离心机购自德国Eppendorf 股份公司等。

1.2 细胞模型制备及分组处理

完全培养基的配制：向DMEM 高糖培养基中加入10%胎牛血清、100 U/mL青链霉素，上下颠倒混匀即可。

将购买的冻存细胞株在39 ℃水浴中快速融化，1 000 r/min，室温离心5 min，以完全培养基重悬后混匀，置于37 ℃，5%二氧化碳细胞培养箱中培养，细胞长至85%左右时，以胰蛋白酶消化，1∶3比例传代，接种在4个24孔板中，继续培养24 h。随机数字表法分为对照组、模型组、4-PBA 组、葛根素组、葛根素+4-PBA 组，除对照组，其余各组参照文献，以1 μg/mL LPS 处理MC3T3-E1 细胞24 h 建立成骨细胞炎症模型，同时4-PBA 组细胞以1 mmol/L 4-PBA（以DMEM 高糖培养基溶解）处理，葛根素组细胞以10 nmol/L 葛根素（以DMEM 高糖培养基溶解）处理，葛根素+4-PBA 组细胞同时以1 mmol/L 4-PBA 及10 nmol/L 葛根素处理，继续培养24 h，其中三板收集各组细胞备用，另一板收集各组细胞培养液后，细胞经PBS 漂洗后，以4%多聚甲醛溶液固定后备用。

1.3 各组细胞成骨分化检测

1.3.1 茜素红染色 取1.2 中4%多聚甲醛固定的一板细胞，每孔加入250 μL 茜素红染色液，室温孵育30 min，吸出染液，以PBS 漂洗后，在显微镜下观察矿化结节染色情况，任取5个视野拍照，判定各组细胞矿化结节相对比例，对照组设为100%，矿化结节相对比例=实验组矿化结节数/对照组矿化结节数×100%。

1.3.2 ALP活性检测 取1.2中收集的一板细胞，加入蛋白裂解液后，冰浴中裂解1 h，3 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清液，使用ALP检测试剂盒检测各组细胞ALP活性水平，具体步骤参照说明书。

1.4 各组细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6水平检测

取1.2 中收集的各组细胞培养液，3 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液，以ELISA 试剂盒检测各组细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6 水平，具体步骤参照说明书。

1.5 各组细胞Runx2、OPN、OCN、OPG、RANKL mRNA 水平检测

取1.2 中收集的另一板细胞，加入RNAiso Plus，参照说明书的步骤提取总RNA，采用逆转录试剂盒将其逆转录为cDNA 后，以荧光定量PCR 试剂盒进行qRT-PCR 反应，每个样品设3 个复孔取均值，反应体系的配制及反应条件的设定参照说明书，以GAPDH 做为内参基因，采用2算法对数据进行分析，目标基因和内参基因引物序列见表1。

1.6 各组细胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达水平检测

取1.2 中收集的最后一板细胞，加入蛋白裂解液后，冰浴中裂解1 h，3 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清液，参照说明书的操作步骤以BCA 试剂盒测定各组总蛋白浓度，根据目的蛋白分子量配制适宜浓度的SDS-PAGE 凝胶，取含相同质量总蛋白各组样品液进行SDS-凝胶电泳，转移蛋白至PVDF膜上，加入5%脱脂奶粉，室温封闭2 h，截取蛋白条带置于小盒中，分别加入兔源GRP78、PERK、CHOP、GAPDH 一抗，4 ℃，孵育过夜，以TBST 漂洗后，以羊抗兔二抗室温孵育2 h，经TBST 漂洗后，以增强化学发光法显色，凝胶成像仪拍摄图片，并以Image J 软件分析蛋白条带，得出各组蛋白相对表达量。

表1 目标基因和内参基因引物序列

1.7 统计学方法

采用SPSS 24.0 软件对数据进行统计分析，计数数据以率（%）表示；计量数据以x ± s表示，组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MC3T3-E1 细胞成骨分化检测结果

与对照组相比，模型组MC3T3-E1 细胞矿化结节相对比例、ALP 活性明显降低（P ＜0.05）。与模型组相比，4-PBA 组、葛根素组、葛根素+4-PBA 组MC3T3-E1 细胞矿化结节相对比例、ALP 活性均升高（P ＜0.05）。与4-PBA 组、葛根素组分别相比，葛根素+4-PBA 组MC3T3-E1 细胞矿化结节相对比例、ALP 活性均升高（P ＜0.05），4-PBA 组、葛根素组MC3T3-E1细胞矿化结节相对比例、ALP 活性相比差异无统计学意义（P ＞0.05），见图1、表2。

2.2 各组MC3T3-E1细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6 水平检测结果

与对照组相比，模型组MC3T3-E1 细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6 水平明显升高（P ＜0.05）。与模型组相比，4-PBA组、葛根素组、葛根素+4-PBA组MC3T3-E1细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6水平均降低（P ＜0.05）。与4-PBA组、葛根素组分别相比，葛根素+4-PBA组MC3T3-E1细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6水平均降低（P ＜0.05），4-PBA组、葛根素组MC3T3-E1 细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6水平比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表3。

2.3 各组MC3T3-E1 细胞成骨相关基因Runx2、OPN、OCN mRNA 水平检测结果

与对照组相比，模型组MC3T3-E1 细胞Runx2、OPN、OCN mRNA 水平明显降低（P ＜0.05）。与模型组相比，4-PBA组、葛根 素 组、葛根素+4-PBA 组MC3T3-E1 细胞Runx2、OPN、OCN mRNA 水平均升高（P ＜0.05）。与4-PBA组、葛根素组分别相比，葛根素+4-PBA 组MC3T3-E1细胞Runx2、OPN、OCN mRNA水平均升高（P ＜0.05），4-PBA组、葛根素组MC3T3-E1细胞Runx2、OPN、OCN mRNA 水平比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表4。

表2 各组MC3T3-E1细胞矿化结节相对比例、ALP活性比较/-x ± s

表3 各组MC3T3-E1细胞培养基上清液中TNF-α、IL-6水平比较/（pg/mL，x ± s）

2.4 各组MC3T3-E1 细胞OPG 及RANKL mRNA水平检测结果

与对照组相比，模型组MC3T3-E1细胞OPG mRNA 水平明显降低（P ＜0.05），RANKL mRNA 水平明显升高（P ＜0.05）。与模型组相比，4-PBA组、葛根素组、葛根素+4-PBA组MC3T3-E1细胞OPG mRNA 水平均升高（P＜0.05），RANKL mRNA 水平均降低（P ＜0.05）。与4-PBA 组、葛根素组分别相比，葛根素+4-PBA 组MC3T3-E1 细胞OPG mRNA 水平均升高（P ＜0.05），RANKL mRNA 水平均降低（P ＜0.05），4-PBA 组、葛根素组MC3T3-E1 细胞OPG mRNA 水平及RANKL mRNA 水平比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表5。

表4 各组MC3T3-E1细胞成骨相关基因Runx2、OPN、OCNmRNA水平比较/x ± s

表5 各组MC3T3-E1细胞OPG及RANKL mRNA水平比较/x ± s

2.5 各组MC3T3-E1细胞GRP78/PERK/CHOP 通路蛋白表达水平检测结果

与对照组相比，模型组MC3T3-E1 细胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达水平明显升高（P ＜0.05）。与模型组相比，4-PBA 组、葛根素组、葛根素+4-PBA 组MC3T3-E1 细胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达水平均降低（P ＜0.05）。与4-PBA 组、葛根素组分别相比，葛根素+4-PBA 组MC3T3-E1 细胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达水平均降低（P ＜0.05），4-PBA 组、葛根素组MC3T3-E1细胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见图2、表6。

3 讨论

图2 免疫印迹检测MC3T3-E1细胞葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）及内质网应激蛋白（CHOP）蛋白表达水平情况

表6 各组MC3T3-E1细胞GRP78、PERK、CHOP蛋白相对表达/x ± s

在骨折、牙周炎等疾病中，LPS 诱导的炎症反应可影响骨代谢，破坏成骨与破骨的动态平衡，抑制骨形成，促进骨吸收，造成骨折不愈合、牙槽骨的吸收萎缩等后遗症，因此，抑制LPS 诱导的炎症反应，减轻骨吸收，增强骨形成具有重要的临床意义。RANKL 是成骨系细胞分泌的破骨细胞形成及激活调节因子，OPG 是其分泌的骨保护蛋白，能结合RANKL，减弱破骨细胞介导的骨吸收，LPS 通过下调OPG 表达，上调RANKL 表达，促进骨吸收，而葛根素可促进人成骨细胞分泌OPG，抑制RANKL 合成，进而增强骨形成，减轻骨吸收，是一种有效预防及延缓骨质疏松症的药物，因而葛根素可能通过促进OPG 表达，抑制RANKL 表达来拮抗LPS 对成骨前体细胞成骨分化的抑制作用。本研究结果显示，模型组MC3T3-E1 细胞矿化结节相对比例、ALP活性、细胞Runx2、OPN、OCN 及OPG mRNA 水平明显降低，细胞培养基上清液中TNF-α及IL-6水平、细胞RANKL mRNA 水平明显升高，表明LPS可引起细胞炎症反应，抑制OPG mRNA 表达，促进RANKL mRNA 表达，抑制成骨相关基因Runx2、OPN、OCN mRNA 表达，进而抑制成骨分化，揭示模型建立成功。模型细胞经葛根素处理后，MC3T3-E1 细胞矿化结节相对比例、ALP 活性、细胞Runx2、OPN、OCN及OPG mRNA 水平均升高，细胞培养基上清液中TNF-α 及IL-6 水平、细胞RANKL mRNA 水平均降低，表明葛根素可减轻细胞炎症反应，逆转LPS诱导的OPG mRNA 表达下调，RANKL mRNA 表达上调，进而拮抗LPS 对成骨分化的抑制，揭示葛根素可抑制LPS导致的骨吸收，维持骨代谢平衡。

由实验结果可知，模型细胞GRP78、PERK、CHOP蛋白表达明显升高，葛根素拮抗LPS作用的同时，可下调GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达，揭示GRP78/PERK/CHOP通路可能是葛根素发挥作用的靶点。研究发现，GRP78/PERK/CHOP通路是调控内质网应激的主要信号，LPS 可引起内质网应激反应，上调GRP78/PERK/CHOP 信号表达，抑制内质网应激反应，下调GRP78/PERK/CHOP 通路表达，可促进成骨细胞增殖及分化，而在淀粉样β诱导的视网膜色素上皮细胞炎症反应中，葛根素可通过抑制ROS 表达，抑制内质网应激，因此推测抑制GRP78/PERK/CHOP信号通路可能是葛根素抑制LPS导致的骨吸收的作用机制。本研究结果显示，以内质网应激抑制剂4-PBA 处理MC3T3-E1 细 胞，细 胞GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达下调，其矿化结节相对比例、ALP 活性、细胞Runx2、OPN、OCN 及OPG mRNA 水平均升高，细胞培养基上清液中TNF-α 及IL-6 水平、细胞RANKL mRNA水平均降低，表明抑制GRP78、PERK、CHOP蛋白表达，4-PBA处理组与葛根素单用组上述各项结果比较差异无统计学意义，说明二者均可减轻细胞炎症反应，逆转LPS 诱导的OPG mRNA 水平降低，RANKL mRNA水平升高，进而减轻对成骨分化的抑制，以葛根素及4-PBA联合处理MC3T3-E1细胞，使细胞矿化结节相对比例、ALP活性、细胞Runx2、OPN、OCN 及OPG mRNA 水平进一步升高，细胞培养基上清液中TNF-α及IL-6水平、细胞RANKL mRNA 水平及GRP78、PERK、CHOP 蛋白表达进一步降低，表明葛根素和4-PBA可协调抑制GRP78、PERK、CHOP蛋白表达、减轻细胞炎症反应、拮抗LPS对成骨分化的抑制，对LPS 下调OPG mRNA 表达，上调RANKL mRNA 表达的逆转作用更强，揭示葛根素上调OPG mRNA水平，下调RANKL mRNA水平，抑制LPS诱导的炎症反应并拮抗其对成骨前体细胞成骨分化抑制的药理机制可能是下调GRP78/PERK/CHOP通路。

总之，葛根素可减轻LPS诱导的细胞炎症反应，逆转LPS 下调OPG mRNA 表达，上调RANKL mRNA表达的作用，拮抗LPS对成骨分化的抑制，为临床牙周病的治疗提供了新的思路，下调GRP78/PERK/CHOP 通路，抑制内质网应激可能是其作用机制，但本研究未上调该通路进行对照验证，还存在证据不全的缺点，需要进一步的深入研究。

（本文图1见插图2-1）