一株野生双孢蘑菇的驯化栽培研究

康曼，韩建荣

（1.桂林医学院 基础医学院，广西 桂林 541199；2.山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

0 引言

双孢蘑菇（Agaricusbisporus），亦称洋菇、双孢菇、白蘑菇等，其在分类上属真菌门（Eumycota），担子菌纲（Basidiomycetes），伞菌目（Agaricales），伞菌科（Agaricaceae），蘑菇属（Agaricus）。双孢蘑菇是全球产量最高、栽培最广的食药用菌之一，其美味可口、营养丰富［1］，且具有抗肿瘤、抗炎、降血糖及降低胆固醇等作用［2-8］。

从野生双孢蘑菇报道来看，我国分布的野生双孢蘑菇主要为白色和棕色两种，主要分布在新疆、安徽、西藏、四川、山西等地［9-14］。

本实验室在山西省太原市小店区分离得到一株白色野生双孢蘑菇G1菌株［15-16］。初步研究发现，与一般双孢蘑菇相比，G1菌株可以在无菌琼脂培养基和麦粒培养基上形成大量原基，且原基最终能发育为结构完整的子实体［17］。经文献查阅，未见其他双孢蘑菇有此特性报道，所以G1菌株是一个比较理想的研究双孢蘑菇原基及子实体分化机理的菌株。我国野生双孢蘑菇资源比较匮乏，为了开发利用该野生资源，本文进行了G1菌株的驯化栽培研究，包括母种培养基、原种培养基和栽培料的筛选，可为双孢蘑菇G1菌株的开发利用和后期规模化栽培提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

野生双孢蘑菇G1菌株采自山西省太原市小店区黄陵村附近菜地，经组织分离法得到纯菌株，保存于马粪琼脂斜面上，标本现保存于中国典型培养物保藏中心，菌株编号2016011。

1.2 培养基

1.2.1 母种培养基

A玉米粉蔗糖培养基：玉米粉40 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；

B麦粒煮汁培养基I：麦粒200 g、蛋白胨2 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1 000 mL、pH自然；

C马铃薯半合成培养基I：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、维生素 B110 mg、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.0；

D麦粒煮汁培养基II：麦粒100 g、蛋白胨2 g、MgSO41.5 g、KH2PO41 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1 000 mL、pH自然；

E马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；

F葡萄糖＋麦芽糖＋酵母膏培养基：葡萄糖10 g、麦芽膏 10 g、酵母膏 4 g、琼脂 20 g、蒸馏水 1 000 mL、pH自然；

G马粪培养基：干马粪150 g、蔗糖50 g、琼脂20 g、石膏20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；

H麸皮培养基：麸皮150 g、蔗糖50 g、琼脂20 g、石膏20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；

I合成培养基：葡萄糖10 g、琼脂20 g、CaCO32 g、KH2PO40.5 g、NaCl 0.2 g、酵母汁 100 mL（1∶10）、MgSO40.2 g、蒸馏水900 mL、pH自然。

上述培养基按配方制备后于121.3℃，灭菌20 min后备用。

1.2.2 原种培养基

麦粒培养基：取新鲜、无霉变麦粒，清洗干净于沸水中煮0.5 h，摊晾后装于罐头瓶中，使含水量为40%左右，每瓶装量200 g；

小米培养基：取新鲜、无霉变的小米，温水浸泡0.5 h后，摊晾，其余制作方法同麦粒培养基；

玉米培养基：取新鲜、无霉变的玉米，温水浸泡2 h～3 h后，摊晾，其余制作方法同麦粒培养基；

棉籽壳木屑培养基（下文中所有%都代表质量分数）：棉籽壳80%、木屑12%、麸皮5%、葡萄糖1%、石膏1%、过磷酸钙1%。称取各组分，搅拌，加水，调节含水量为65%，装瓶；

棉籽壳麦麸培养基：棉籽壳87%、麦麸10%、过磷酸钙1%、葡萄糖1%、石膏1%。称取各组分，搅拌，加水，调节含水量为65%，装瓶；

粪草培养基：玉米秆70%、干牛粪20%、豆饼7.5%、过磷酸钙1%、石膏粉1%、尿素0.5%，采用常规方法堆制发酵［1］后，装瓶。

上述原种培养基按配方制备后于121.3℃，灭菌60 min后备用。

1.3 栽培料

1.3.1 栽培料配方

配方1（稻草栽培料）：稻草80%、麦麸12%、牛粪5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方2（玉米芯栽培料）：玉米芯80%、麦麸12%、牛粪5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方3（玉米秸秆栽培料）：玉米秸杆80%、麦麸12%、牛粪5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方4（棉籽壳栽培料）：棉籽壳80%、麦麸12%、牛粪5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方5（木屑栽培料）：木屑70%、麦麸22%、牛粪5%、蔗糖1%、石膏1%、KH2PO41%；

配方6（玉米秸秆牛粪栽培料）：玉米秸秆70%、干牛粪20%、豆饼7.5%、过磷酸钙1%、石膏1%、尿素0.5%；

配方7（马粪稻草栽培料）：干马粪56%、稻草40%、硫酸铵 1%、尿素 1%、石膏 1%、过磷酸钙1%。

上述栽培料按配方制备后，121.3℃灭菌120 min后备用。

1.3.2 栽培料制作方法

配方1—5制作方法：稻草、玉米秸杆、玉米芯预先粉碎为直径约1 cm碎块，分别将各主料（稻草、玉米秸杆、玉米芯、棉籽壳、木屑）浸泡于自来水中，过夜，沥干水分，按比例加入麦麸、牛粪、蔗糖、石膏、KH2PO4，拌匀，调节含水量为65%。配方6玉米秸秆牛粪栽培料采用常规方法［1］堆制发酵。配方7马粪稻草栽培料购自山西宇昊蘑菇种植有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 母种培养基的筛选

将G1菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板中央，25℃，培养12 d，在菌落边缘用打孔器（直径5 mm）打孔，分别取1块菌饼接入不同的母种培养基平板中心位置，25℃培养，每一处理5次重复，观察菌落形态，计算菌丝体生长速度［18］。

1.4.2 原种培养基的筛选

将G1菌株同步菌丝体接入供试的原种培养基上，25℃培养，每一处理3次重复，观察菌丝体的生长情况，计算生长速度。

1.4.3 栽培料的筛选

菌袋的制作：将制作好的不同配方栽培料装入16 cm×33 cm聚丙烯袋中，每袋装湿料400 g，121.3℃，灭菌120 min，自然冷却后，接入10 g麦粒种，每个处理12袋。

发菌：将上述菌袋放入培养箱中培养（25℃），观察记录菌丝体在不同栽培料中的吃料情况，待菌丝体长满袋后，继续培养10 d。

覆土：将发好菌的菌袋移至出菇房，随机摆放于不同层架上，打开菌袋，袋口朝上，覆上直径约1.5 cm左右的粗土，厚度2 cm左右，反复喷水至覆土充分吸水而不渗流入栽培料中，菇房湿度80%左右，温度自然，待菌丝爬上粗土后，覆上细土，厚度1 cm左右。

出菇期管理：调节菇房温度为14℃～22℃，空气湿度95%，每天开窗通风1 h，保证覆土层湿润并给予一定的散射光照以刺激子实体的分化。观察并记录原基、子实体发生时间。

采收：G1菌株在子实体尚未开伞时采收，整个采收期80 d，即从覆土到采收结束的时间。

记录各配方每个菌袋中产生子实体的数量、重量、栽培性状，计算生物学效率、产量、出菇的潮数等，产量＝每袋子实体平均鲜重；生物学效率［19］＝每袋子实体平均鲜重（g）/栽培料干重×100；单菇重＝每袋子实体重量/子实体个数。每种栽培料上随机采10个子实体，测量记录菌柄直径、长度，菌盖直径和厚度，计算平均值［20］。

2 结果与分析

2.1 母种培养基筛选结果

双孢蘑菇G1菌株在不同母种培养基（A—I）上生长情况见图1和表1。G1菌株在麸皮培养基上的生长速度最快（2.23 mm/d），显著高于在马粪培养基上的生长速度（2.07 mm/d），但在马粪培养基上菌丝体洁白、浓密、长势最好。在马铃薯半合成培养基I和麦粒煮汁培养基II上，菌丝体生长速度差异不显著（P＜0.05）。同样，在麦粒煮汁培养基I和马铃薯葡萄糖琼脂培养基上G1菌株生长速度差异不显著（P＜0.05）。在葡萄糖＋麦芽糖＋酵母膏培养基和合成培养基上，菌丝体虽然致密，但生长速度非常缓慢（0.65和0.72 mm/d），差异不显著（P＜ 0.05）。综合考虑，G1菌株最适母种培养基为马粪培养基，其次为麸皮培养基。此外，发现G1菌株在部分培养基上可以形成原基及子实体。

图1 不同母种培养基上双孢蘑菇G1的菌落形态（A-I培养基名称见1.2.1）Fig.1 Colonies of Agaricus bisporus strain G1 on different original strawn media（the names of A-I media are shown in part 1.2.1）

表1 不同母种培养基上双孢蘑菇G1菌丝体生长情况Table 1 Growth situations of mycelia of Agaricus bisporus G1 on different original strawn media

2.2 原种培养基筛选结果

不同原种培养基上G1菌株菌丝体生长情况见表2。G1菌株在玉米和小米培养基上萌发速度最快（36 h），在棉籽壳木屑培养基和棉籽壳麦麸培养基上萌发速度较慢（72 h和120 h）；G1菌株在不同原种培养基上菌丝体生长速度差异显著（P＜0.05），其中在小米培养基上生长速度最大（3.84 mm/d），显著高于在其它培养基上的生长速度（P＜0.05）；在棉籽壳麦麸培养基上生长速度最小（1.44 mm/d）。从长势来看，在麦粒和小米培养基上，菌丝体长势最好。综合萌发时间、生长速度及菌丝体长势，G1菌株最适的原种培养基为小米培养基，其次为麦粒和玉米培养基。

表2 不同原种培养基上双孢蘑菇G1菌丝体生长情况Table 2 Growth situations of mycelia of Agaricus bisporus strain G1 on different strawn media

2.3 栽培料筛选结果

由表3可知，双孢蘑菇G1菌株能在发酵料即配方6（玉米秸秆牛粪栽培料）和配方7（马粪稻草栽培料）上产生原基及子实体，而在非发酵料（配方1—5）上菌丝体生长缓慢，不能形成原基及子实体。在配方6栽培料上子实体产量、生物学效率及所产蘑菇数量均高于配方7，在配方6和7上产生的子实体单菇重分别为4.73 g和4.93 g。在配方7上产生原基的时间为12 d，比在配方6上早5 d。在这两种栽培料上，从覆土到采收结束的80 d，G1菌株均产生了2潮菇，且所产子实体干物质含量分别为9.49%和9.78%。

表3 双孢蘑菇G1菌株在不同栽培料上的出菇情况和干物质含量Table 3 Quantitative production parameters and dry matter contents of the harvested Agaricus bisporus G1 during a harvesting period of 80 days

G1菌株在配方6和7上均可产生子实体，子实体白色，近半球形，多数散生，菌盖白色，幼时平滑，后期表面具小绒毛，菌柄白色、中实，呈中央着生。其子实体形态与其他白色双孢蘑菇相似［21］（表4）。由表可知，在配方6上产生的子实体的菌盖直径与厚度稍低于配方7；但在配方6上产生的子实体菌柄的长度和直径稍高于配方7。总体来讲，G1菌株产生的子实体小于一般的双孢蘑菇。综合生物学效率、产量、子实体产生时间等因素，G1菌株最适栽培料为配方6即玉米秸秆牛粪栽培料。

表4 G1菌株在不同栽培料上产生的子实体性状Table 4 Diameters and lengths of Agaricus bisporus G1 fruiting bodies cultivated on different substrates

3 分析与讨论

本研究通过分析G1菌株在不同母种、原种培养基上的生长速度和菌丝体长势，筛选出了其最适母种、原种培养基。根据试验结果，G1菌株在麸皮培养基上生长速度最快，但菌丝体较稀疏。在食用菌的培养过程中，菌丝健壮与否对后续的栽培及产量有明显的影响。虽然G1菌株在马粪培养基上生长速度低于麸皮培养基，但菌丝体浓密，健壮，且马粪培养基成本较低，适宜规模化生产制种，所以G1菌株最适母种培养基为马粪培养基。根据菌丝体生长速率和长势，G1菌株最适的原种培养基为小米培养基，但该培养基成本较高，且制作过程容易染菌，所以该培养基适用于实验室小规模制种，不适宜大规模生产制种。

栽培结果表明：G1菌株在非发酵料上菌丝体生长缓慢，不能产生原基及子实体，在马粪稻草和玉米秸秆牛粪这2种发酵栽培料上菌丝体生长健壮，且能产生原基及子实体，这与其他双孢蘑菇对栽培料性质的要求基本相同［1］，其原因可能由于菌丝体在发育过程中的需求不同所致，所以不同菌株的生理特性和培养特性不同［22］，相比于马粪稻草栽培料，G1菌株在玉米秸秆牛粪栽培料上生物学效率和产量更高，但和已商业化的双孢蘑菇栽培品种相比，G1菌株的生物学效率和产量偏低。Martínez-Carrera等［23］对分离自莫斯科的10野生双孢蘑菇进行了栽培，其中很多种产量偏低，这说明蘑菇属是较易驯化的一个属，尽管其产量偏低。此外，由于产量受多种因素的影响，包括营养、温度、光照、最适pH值以及通风，只有在适宜的条件下，子实体的产量及生物学效率才会较高，G1菌株的生物学效率较低，可能与栽培条件有关，所以下一步有必要研究其适宜的栽培条件。

在摸索栽培条件时，当栽培温度较低（14℃左右），湿度较低时（30%～50%），G1子实体会出现一些畸形菇，即在菌盖上再长一个小蘑菇，这说明G1菌株的结实能力较强。经文献检索，未见相关报道。此外，G1菌株在麦粒培养基和琼脂培养基上可以形成原基，且原基并能进一步分化为子实体，而其他双孢蘑菇相关报道非常少，对这些现象有必要进行进一步的研究。