根际硫酸盐对拟南芥植株干旱生理的调节作用

李晋圆，郝丽宏，仪慧兰

（山西大学 生命科学学院，山西 太原 030006）

0 引言

干旱影响植物生长发育，是限制农业生产的关键因素［1-2］。干旱胁迫引发植株体内活性氧（ROS）积累，破坏细胞氧化还原平衡，高水平ROS可使生物大分子蛋白质、核酸、膜脂等结构损伤、功能异常，继而影响植物生命活动［1］。作为固着生长的植物，遭遇干旱胁迫时，机体会迅速感知干旱信号，发生一系列生理性应答，如调节气孔开度减少水分散失，激活干旱响应基因调整细胞生理代谢过程，引发渗透调节物质脯氨酸等积累维持细胞膨压，诱导细胞抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽硫转移酶（GST）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等活性升高、非酶抗氧化物如谷胱甘肽、抗坏血酸（AsA）等合成增加，以维持植株干旱生理［3-4］。研究发现，植株体内SO42-分布［5］、谷胱甘肽合成、GPX活性及硫还原过程对干旱生理有直接影响［6-8］。

硫作为植物必需的大量营养元素，在种子萌发、生长发育、逆境响应等生命活动中发挥着重要作用［8-9］。植物生长发育需要的硫主要是根从土壤中摄取的硫酸盐，由气孔进入的SO2也可作为硫营养的补充。植物细胞中的无机硫化合物，经硫同化途径合成半胱氨酸（Cys）［10］。Cys是许多重要生物分子，如蛋氨酸、谷胱甘肽等的前体物质。谷胱甘肽作为高效抗氧化剂或信号分子参与细胞氧化还原平衡，在维持细胞稳态中具有不可替代的作用［8］。前期我们发现，SO2暴露可诱导拟南芥和谷子植株抗氧化能力提高、渗透调节物质积累，对干旱的适应性增强［11-12］，同期发生的硫同化增强提供了细胞高水平的Cys、谷胱甘肽，促进了GST和GPX的高活性，在植株逆境适应中发挥了重要作用［13］。但是，植株根际硫含量是否影响植物干旱生理少有报道。

干旱是造成农作物减产的主要因素，威胁着全球的粮食生产安全［1］。近年来全球各地耕地缺硫的国家和地区在逐年增加［14］，因此，植物可能会同时遭遇干旱与硫营养缺乏，在无力实现灌溉的情况下是否可以通过土壤硫素调节植株干旱生理缺少研究。本文以模式生物拟南芥（ArabidopsisthalianaL.）为材料，研究根际硫水平对拟南芥干旱生理的影响，探讨利用外源硫对植物干旱生理进行调节的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料准备及实验处理

平板培养拟南芥所用培养基1/2 MS中包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，其中的硫素主要由MgSO4提供。以1/2 MS培养基中的硫浓度（0.75 mmol·L-1）为 1S，设 4 个不同硫浓度组，即1/4S、1S、3S和9S组，4组培养基中的硫含量分别为1S的1/4、1倍、3倍和9倍。低硫组在Mg2+总量不变的情况下调整MgSO4和MgCl2的比例来控制硫的含量，高硫组在1/2 MS培养基中添加无水Na2SO4达到预定硫浓度。每个硫浓度组设对照组（表示为：CK-1/4S、CK-1S、CK-3S、CK-9S）和干旱组（表示为：T-1/4S、T-1S、T-3S、T-9S）。干旱处理采用 100 mmol·L-1甘露醇模拟［15］。

取拟南芥 Columbia（Col-0）生态型种子，用15%次氯酸钠溶液浸泡15 min，ddH2O洗涤后点播于上述制备的不同培养基上，每皿40粒种子。平皿于4℃春化3 d后转入光照培养箱，光照强度≥3 000 Lx，光/暗周期为16 h/8 h，相对湿度约60%～70%，温度（22±1）℃。进行根长测量的平皿垂直放置于培养箱内，用于其他生化指标检测的平皿水平放置。每个实验设3个重复。从平皿转入光照培养箱内开始计算培养天数。

1.2 根长测量与根端H2O2组织化学染色

在培养5 d、7 d、9 d和11 d时对各组拟南芥幼苗根部拍照并用ImageJ软件测量主根根长。取生长11 d的拟南芥幼根，参照Hu的方法［16］，进行DAB染色，光学显微镜观察拍照。

1.3 相对含水量（RWC）的测定

参照王敏瑞等方法［17］，取2周龄拟南芥地上部分，称鲜重（FW）后于蒸馏水中浸泡，达到恒重时称重，记为饱和鲜重（TW），再于105℃杀青1 h，85℃烘至恒重，记为干重（DW），相对含水量计算公式为：

RWC（%）＝（FW-DW）/（TW-DW）×100。

1.4 生理生化指标测定

取2周龄拟南芥地上部分，H2O2含量采用试剂盒（南京建成）测定；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法测定，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定［18］；SOD活性的测定参考杨浩等的方法［19］；Cys含量采用Gaitonde的方法［20］；总谷胱甘肽（TGSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量采用试剂盒（碧云天）测定，还原型谷胱甘肽（GSH）含量由TGSH减去GSSG获得；GST活性测定采用Habig等的CDNB比色法［21］；GPX活性测定采用Wendel的方法［22］。

1.5 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 硫对拟南芥幼根生长和干旱生理的影响

拟南芥根长测量发现，CK-1S组幼苗的主根最长，在培养第5 d—11 d间，CK-1S组根长增幅显著高于其他各组（P＜0.05），与预期一致（图 1a），说明低硫或高硫对拟南芥根系生长发育产生了不利影响；干旱组（T）主根长度显著短于非干旱对照组（CK），且干旱条件下T-3S组主根生长较好，在生长11 d时T-3S组主根最长，与其他三组有显著差异（P＜0.05）（图 1b）。

DAB染色的深浅可反映植物细胞中H2O2含量的高低。如图1c所示，CK-1S组拟南芥根部颜色最浅，与预期一致；干旱组根部颜色明显深于非干旱对照组，且T-1S和T-3S组颜色较浅，T-1/4S和T-9S组颜色较深，表明干旱胁迫时拟南芥根部H2O2水平升高，根际硫浓度改变会影响H2O2的积累，适当提高根际硫水平可降低干旱引发的氧化胁迫。由于T-3S组拟南芥生长较好，我们选择1S和3S两个硫浓度进行后续研究。

（a）非干旱；（b）干旱；（c）培养11 d时幼根DAB染色；CK：对照，T：干旱图1 硫含量对拟南芥幼苗主根长度及根端H2O2积累的影响（a）Non-drought；（b）Drought；（c）DAB staining of root tips after 11-days culture.CK：Control.T：DroughtFig.1 Effect of sulfate level on root length and H2O2accumulation in root tips of Arabidopsis seedlings

2.2 硫对拟南芥地上部分RWC和脯氨酸含量的影响

RWC是衡量植株持水状态的指标，非干旱条件下拟南芥CK-1S组和CK-3S组的RWC无显著差异（P＞0.05），干旱条件下T-1S组和T-3S组RWC显著低于非干旱对照组（P＜0.05），且T-3S组RWC比T-1S组提高约17.4%（图 2a），表明在本研究设计的干旱处理中拟南芥植株严重失水，而3S处理提高了植株的保水能力。

图2 硫含量对拟南芥幼苗地上部分相对含水量及脯氨酸含量的影响Fig.2 Effect of sulfate level on RWC and proline contents in the shoots of Arabidopsis seedlings

干旱胁迫时植株能迅速积累脯氨酸等渗透调节物质，以提高抗旱能力和抗逆性。非干旱条件下CK-1S组和CK-3S组拟南芥地上部分脯氨酸含量接近；干旱组拟南芥脯氨酸含量显著高于非干旱对照组（P＜0.05），且T-3S组脯氨酸含量显著高于T-1S组（P＜0.05）（图 2b）。结果表明，根际3S能使植株在干旱条件下积累更多脯氨酸，从而有利于植株保持较高的水势，维持较高的RWC。

2.3 硫对拟南芥地上部分H2O2、MDA含量和SOD活性的影响

拟南芥CK-1S与CK-3S组地上部分H2O2（图3a）和MDA（图 3b）含量无显著差异（P＞0.05），说明非干旱条件下根部高硫未对植株造成氧化损伤；干旱胁迫时，拟南芥H2O2和MDA含量，以及SOD活性均显著高于非干旱对照组（P＜0.05），但T-3S组与T-1S组相比，H2O2和MDA含量分别降低15.4%和18.6%，SOD活性显著升高（P＜0.05）（图3c）。以上结果表明，采用干旱胁迫诱发了拟南芥植株的氧化胁迫和氧化损伤，根际较高的硫含量（3S）有益于维持植株的氧化还原平衡，抑制干旱引起的氧化损伤，从而增强拟南芥植株对干旱的适应性。

图3 硫含量对拟南芥幼苗地上部分H2O2（a）、MDA含量（b）和SOD活性的影响（c）Fig.3 Effect of sulfate level on H2O2（a），MDA contents（b）and SOD activity（c）in the shoots of Arabidopsis seedlings

2.4 硫对拟南芥地上部分Cys和GSH含量的影响

非干旱组拟南芥CK-1S与CK-3S组地上组织中Cys、总谷胱甘肽（T-GSH）、GSH和GSSG含量无显著差异（P＞0.05），说明植物对硫的吸收与利用有严格的调控，在一定限度内，根际硫酸盐浓度改变对硫同化过程没有明显影响。干旱时T-1S与T-3S组的Cys、T-GSH、GSH和GSSG含量显著高于非干旱对照组（P＜0.05），说明干旱时拟南芥硫同化产物Cys和GSH合成增加。与T-1S组相比，T-3S组的Cys、T-GSH、GSH及GSSG含量不同程度升高（图4）。结果说明，干旱会影响拟南芥植株对硫的吸收和转化，适当提高根际硫水平可使干旱期间植株维持更高水平的Cys和GSH。

图4 硫含量对拟南芥幼苗地上部分Cys和GSH含量的影响Fig.4 Effect of sulfate level on Cys and GSH contents in the shoots of Arabidopsis seedlings

2.5 硫对拟南芥地上部分GST和GPX活性影响

拟南芥地上部分GST和GPX活性在非干旱组CK-1S与CK-3S组间无显著差异（P＞0.05），在干旱胁迫后显著升高，且T-3S组GST活性显著高于T-1S组（P＜0.05）（图 5）。结果表明，干旱可诱导拟南芥GST和GPX活性升高，适当提高根际硫含量能使拟南芥植株在干旱期间拥有高活性的GST，从而具有较强的解毒能力。

图5 硫含量对拟南芥幼苗地上部分GST和GPX活性的影响Fig.5 Effect of sulfate level on GST and GPX activities in the shoots of Arabidopsis seedlings

3 讨论

干旱是影响粮食生产的主要因素，我国旱灾发生频繁，干旱半干旱范围和面积不断增大，受旱区域由北向南逐渐扩增，严重影响着我国经济社会的发展［2］。如何改善农业生产环境提高粮食产量是政府部门和科研人员关注的焦点，对那些不能实施灌溉的地域如何及时解旱是困扰农业生产的一大难题。本研究提供了根际硫水平影响拟南芥植株干旱生理的基础数据，表明根际较高的硫供给对增强植株干旱耐受性有益。

本研究设定的低硫或高硫培养基及干旱处理对拟南芥种子萌发有延迟效应，但72 h后各组萌发率均达到100%，改变硫水平对拟南芥幼苗干旱生理的影响更为明显。非干旱条件下根际低硫或高硫不利于根系生长发育，干旱胁迫抑制拟南芥主根生长和根部形态建成，T-3S组抑制程度低于T-1S组。

硫营养状况会影响植物生长发育及对干旱的适应性。由植株根部吸收的硫酸盐在植物细胞中经硫还原途径产生细胞生理必须的有机硫化合物，这些含硫化合物能通过多种途径和方式参与植物的逆境生理过程［8］。硫还原产生的Cys及下游含巯基肽和蛋白质是维持细胞氧化还原平衡的主要成分，次生代谢产物硫酸胆碱是良好的渗透调节剂［8］。本研究发现，根际硫酸盐含量达标准硫浓度3倍时，可使干旱条件下拟南芥植株的抗氧化能力增强，降低干旱引发的氧化胁迫，促进渗透调节物质脯氨酸积累，提高植株对干旱的适应，该结果与我们实验室前期报道的SO2预暴露后拟南芥植株干旱适应性提高的结果［11］相似，这说明拟南芥植株吸收外源硫促进硫同化有益于提高其抗氧化活性、增强保水能力，从而使植株干旱适应性提高。

植物硫营养代谢的调控十分严格，其中非常重要的调控现象就是需求驱动的硫营养吸收转运及同化代谢［8］。本研究发现，干旱胁迫时拟南芥地上组织Cys含量显著提高（P＜0.05），说明干旱促进了硫同化代谢，T-3S组比T-1S组有更高的Cys含量，并促进T-3S组合成更多的GSH，说明根际较高水平的硫素可以进一步增强硫同化代谢过程，而T-3S组和T-1S组Cys含量无显著差异（P＞0.05），可能与T-3S组合成GSH消耗了更多的Cys有关。细胞内谷胱甘肽有GSH和GSSG两种形式，其中GSH是植物细胞内含量最为丰富的非蛋白巯基化合物，可通过GSH-GSSG循环清除细胞内的ROS［23-24］；当T-GSH增加，GSH稳定维持在较高水平时，系统清除活性氧的能力得到提升［25］。本研究发现，T-3S组GSH占T-GSH含量的90%以上，说明干旱胁迫条件下，增加根际硫供给到标准硫浓度3倍可促使GSH维持在较高水平，加速GSHGSSG循环，进而促进ROS的清除，降低MDA水平。GST是植物细胞内重要的解毒酶，可催化GSH与胞内亲电子有毒物质结合从而脱毒，还能促进有毒物排出细胞［25］，在干旱胁迫后拟南芥组织中GST活性显著提高，根际3S可诱导其活性进一步增强，说明根际硫素对GST解毒能力具有调节作用。

植株硫代谢参与逆境生理中组织的氧化还原平衡、细胞渗透调节、化学防御等过程［26］，硫同化增强及GSH含量提高有益于植物对逆境的适应［8，27］。本研究中根际硫酸盐对拟南芥植株干旱生理期间硫同化的促进作用与我们前期SO2暴露促进干旱条件下拟南芥植株硫同化增强的结果［11，13］相似，说明植株体内存在调控硫同化的信号系统，能够识别干旱胁迫并激活硫同化，而根际高硫或SO2暴露提供了植株细胞内足量的硫同化底物，促进了硫同化相关过程，能合成更多抗氧化剂、渗透调节物和防御分子维持机体较高的防护能力，增强拟南芥植株的干旱适应性。

脯氨酸是植物体内重要的渗透调节物，SO2及其衍生物预暴露后拟南芥、谷子组织中的脯氨酸含量显著增高，叶片相对含水量增加，植株对干旱的耐受性提高［11-12，17］。本研究中干旱组拟南芥脯氨酸含量提高，且T-3S组高于T-1S组，组织相对含水量变化趋势与脯氨酸含量变化趋势一致，说明根际高硫能促进植物细胞合成和积累更多的渗透调节物质，提高干旱条件下细胞的渗透调节能力，减少干旱期间植株的水分散失。此外，脯氨酸还可提高抗氧化酶活性，清除体内的ROS［28］，表明根际高硫诱导的脯氨酸含量升高也能在机体抗氧化应答中发挥作用。

4 结论

植株根际SO42-水平对干旱条件下拟南芥植株生长发育和生理代谢有显著影响，适当提高根际硫供给能促进植株渗透调节物质的积累，减少水分散失，增强硫同化代谢，提高植株抗氧化能力，进而维持植株干旱生理状态、增强植物干旱适应能力。