一株β-甘露聚糖酶生产菌细胞培养条件的优化

蔡莉

（江阴职业技术学院环境与材料工程系，江苏江阴214405）

β-甘露聚糖酶是一种新型酶制剂，属于一种半纤维素酶类，它除了能降解非淀粉多糖（NSP）酶类，还能降低肠道黏度，促进营养物质的消化和吸收。研究表明，甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂，因为它可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率；同时，它还可以消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大地提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率。实际使用中还可看出，添加了β-甘露聚糖酶后动物的抵抗力有所提高。β-甘露聚糖酶在美国用量仅次于植酸酶，实际上它已超脱了传统酶制剂的作用，可以替代抗生素成为一种新型的促生长饲料添加剂。

β-甘露聚糖酶大多是微生物分泌的，包括曲霉属（Aspergillus sp.）、青霉（Penicillium sp.）等丝状真菌以及芽孢杆菌属（Bacillus）和放线菌（Actinomyces）等细菌。本研究拟以实验室自筛菌种地衣芽孢杆菌SY-8为研究对象，为了提高β-甘露聚糖酶的分泌量，须先找到该菌培养的最佳环境条件。

1 材料与方法

1.1 菌种

地衣芽孢杆菌SY-8，实验室保藏菌种。

1.2 发酵培养基

葡萄糖20 g；牛肉膏0.5 g；磷酸二氢钾2.5 g；氯化钠1.0 g；七水合硫酸镁0.2 g；七水合硫酸亚铁0.02 g。定容至500 mL，pH为7.0，118℃灭菌20 min。

1.3 细胞含量测定

适当稀释溶液后，使用0.9% NaCl 溶液作为空白对照，测量其600 nm下的吸光值，菌体密度=光密度值×稀释倍数。以培养时间（d）为横坐标，活菌数测定结果细胞数为纵坐标，绘制地衣芽孢杆菌活菌数测定值随培养时间变化趋势图。

2 结果与分析

在地衣芽孢杆菌SY-8培养过程中，培养温度、摇床转速、传代浓度、pH、渗透压等多种因素会对地衣芽孢杆菌SY-8的生长产生重要影响。

2.1 培养温度对地衣芽孢杆菌SY-8培养的影响

按约1×10cell/mL的细胞浓度进行细胞传代，培养体积为100 mL，培养转速为100 rpm/min，分别测定不同温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）对地衣芽孢杆菌SY-8生长的影响。

图1 不同培养温度对地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长的影响

由图1 可以看出，随着培养天数的变化，地衣芽孢杆菌SY-8细胞浓度不断变化，当培养温度为30℃时，细胞生长情况最好，倍增时间最短，并且培养三天后细胞数量就能达到较高的浓度，而其他温度下，地衣芽孢杆菌SY-8 细胞均生长较为缓慢。所以，地衣芽孢杆菌SY-8细胞的最优生长温度为30℃。

2.2 恒温摇床转速对地衣芽孢杆菌SY-8培养的影响

按约1×10cell/mL的细胞浓度进行细胞传代，培养体积为100 mL，培养温度为30℃，分别测定60 rpm、80 rpm、100 rpm、120 rpm、140 rpm、160 rpm 下地衣芽孢杆菌SY-8细胞数量的变化。

图2 不同转速对地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长的影响

每天监测地衣芽孢杆菌SY-8 细胞的生长情况，由图2看出，在不同的培养转速下，地衣芽孢杆菌SY-8细胞变化幅度较大。当培养转速为100 rpm时，细胞生长情况最好，倍增时间最短，地衣芽孢杆菌SY-8细胞数量最大。而在其他转速下，细胞均生长较为缓慢。所以，地衣芽孢杆菌SY-8细胞的最优培养转速为100 rpm。

2.3 细胞传代浓度对地衣芽孢杆菌SY-8培养的影响

按约1×10cell/mL的细胞浓度进行细胞传代，培养体积100 mL，培养转速为100 rpm/min，分别考查不同接种浓度0.50×10cell/mL、0.75×10cell/mL、1.00 ×10cell/mL、1.25×10cell/mL、1.50×10cell/mL 对地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长的影响。

图3 不同接种浓度对地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长的影响

由图3 可以看出，地衣芽孢杆菌SY-8 细胞在其他培养条件相同的情况下，传代浓度为1.25×10cell/mL时，细胞生长情况最好，倍增时间最短，并且细胞能在第3天达到最高浓度。而在其他传代浓度下，地衣芽孢杆菌SY-8 细胞生长状况均低于浓度为1.25×10cell/mL时。综上所述，地衣芽孢杆菌SY-8 细胞的最优传代浓度为1.25×10cell/mL。

2.4 细胞生长的pH对地衣芽孢杆菌SY-8培养的影响

图4 不同pH对地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长的影响

按约1×10cell/mL的细胞浓度进行细胞传代，分别考查pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8时对地衣芽孢杆菌SY-8生长情况的影响。由图4可以看出，当pH为6.5时，地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长情况最好，倍增时间最短，培养至第6天能达到最高的细胞浓度，而其他pH 条件下，细胞均生长缓慢。因此，地衣芽孢杆菌SY-8细胞的最适pH为6.5。

2.5 细胞生长的渗透压对地衣芽孢杆菌SY-8培养的影响

细胞按初始密度1.0×10cell/mL 进行传代，商品化培养基渗透压约为320 osmol/g，通过添加氯化钠来调节渗透压范围（300～400 osmol/g），以测试不同渗透压对地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长的影响。

图5 不同渗透压对地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长的影响

由图5 可以看出，当渗透压为360 osmol/g 时，地衣芽孢杆菌SY-8细胞生长情况最好，倍增时间最短，而其他渗透压下，地衣芽孢杆菌SY-8细胞产量均较低，说明过高或过低的渗透压都不利于地衣芽孢杆菌SY-8细胞的生存。所以，优化后的地衣芽孢杆菌SY-8 细胞培养的渗透压为360 osmol/g。

3 总结

通过一系列实验数据的探讨得到了地衣芽孢杆菌SY-8细胞最合适培养的参数，分别探讨培养温度、摇床转速、传代浓度、培养pH、渗透压等因素对培养地衣芽孢杆菌SY-8细胞的影响，发现当培养温度为30℃，摇床转速为100 rpm，传代浓度为1.25×10cell/m，培养pH为6.5，渗透压为360 osmol/g 时，地衣芽孢杆菌SY-8 细胞生长情况最好，为大规模培养地衣芽孢杆菌SY-8 细胞提供数据支持。