伏立诺他对严重烫伤大鼠心脏的保护作用

孟祥熙，温海玲，郑金光，胡 森

突发事故和灾害时，短时间内出现大量创伤、烧伤休克伤员，由于环境特殊、交通破坏、护送延迟、液体供不应求等原因使常规静脉液体复苏难以实施，伤员得不到及时救治，死亡率及并发症发生率明显增高。如果能给予抗休克维持药物，提高机体对创伤、休克的耐受能力，保护重要脏器的功能，就能为后续治疗争取时间，提高生存率，减少并发症。在严重烧伤后，体液大量丢失，有效循环血量锐减，心脏供血减少，早期就会出现心肌损伤，心肌细胞水肿、间质充血、心肌坏死，心肌损伤的早期防治对减轻心肌缺血缺氧损害，减少并发症、提高生存率有重要意义[1，2]。伏立诺他(SAHA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，以往研究证实，SAHA能提高失血性休克或烫伤大鼠生存率，保护主要脏器功能[3-7]，但具体机制仍不明确。为此，本实验通过观察伏立诺他对50%TBSAⅢ度烫伤大鼠心肌酶指标、心肌含水率、心肌细胞凋亡率、caspase-3活性的影响及心肌组织病理学变化，为SAHA在严重烧伤早期保护心脏功能方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠，60～70日龄，体重240～260 g，购自北京军事医学科学院动物实验中心，购进后，适应性饲养一周以上，室温维持在22～25 ℃，自由饮食。实验前12 h禁食、自由饮水。

1.2 药品和试剂 辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、戊巴比妥钠购自SIGMA公司，Caspase-3 Assay Kit购自Abcam公司，TUNEL检测阳性对照制备试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.3 仪器 自动生化分析仪(7170型)，日本Hitachi公司产品；高速冷冻离心机(5900)，日本Kubota公司；KD-BM生物组织包埋机，浙江科迪仪器设备公司产品；光学显微镜，奥林巴斯有限公司；多波长酶标仪，Dynex公司。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备及分组 48只雄性SD大鼠，戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉，剪除背部和腹部的毛发，将大鼠放置在预制模板的矩形开口，露出裸露皮肤，同时保护剩余皮肤。随机分为3组：(1)假烫组，采用37 ℃水浴，背部15 s，腹部8 s，浸泡后腹腔内注射0.25 ml生理盐水；(2)烫伤组，于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s烫伤后，腹腔内注射0.25 ml生理盐水；(3)SAHA组，烫伤后腹腔给予SAHA治疗(7.5 mg/kg，溶于0.25 ml生理盐水)。每组根据烫伤3、6 h两个观察时间点，又分为两个亚组(n=8)。

1.4.2 指标检测 烫伤后3、6 h抽取腹主动脉血，胸正中线剖开取心肌组织。(1)抽取腹主动脉血标本，离心后取血浆，全自动生化分析仪测定血浆磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。(2)心肌组织含水率，采用干/湿重法检测大鼠心肌组织含水率。取适量心肌组织，用滤纸将组织表面液体吸干，电子天平准确称重(湿重)，将样本放入电烤箱中80 ℃烘烤72 h，电子天平称重烘干后的样本并记录数值(干重)。含水率(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。(3)心肌细胞凋亡率，TUNEL方法检测凋亡心肌细胞，其原理是荧光素标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3′-OH末端，在荧光显微镜下荧光增强。随机选取心肌组织区域中5个非重叠400高倍镜视野，计数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数，心肌细胞凋亡率(%)=凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100 %。(4)Caspase-3活性，Caspase-3可以催化底物DEVD-p-NA产生黄色的p-NA，从而可以通过测定吸光度来检测caspase-3的活性；按照试剂盒说明书进行操作，混匀，405 nm，读取各管OD值，根据标准曲线方程及光密度值计算样品中caspase-3活性。

2 结 果

2.1 血浆内CK-MB水平 与假烫组[(585.6±46.1)U/L]比较，烫伤组伤后3、6 h血浆内CK-MB水平[(2552.9±145.3)U/L，(5418.7±292.9)U/L]明显升高(均P<0.05),组间比较具有统计学差异；SAHA治疗后，血浆内 CK-MB水平[(1642.4±157.2)U/L，(3475.3±187.5)U/L]较烫伤组明显降低(均P<0.05)。

2.2 心肌组织含水率 烫伤后3、6 h，烫伤组心肌组织含水率[(77.65±1.75)%，(80.23±1.82)%]较假烫组[(70.12±1.99)%]明显升高(均P<0.05),而SAHA组伤后心肌组织含水率[(72.31±1.95)%，(75.21±2.00)%]显著低于烫伤组(均P<0.05)。

2.3 心肌组织TUNEL染色结果 正常心肌纤维排列整齐，肌纤维之间距离紧密，烫伤后, 心肌纤维出现扭曲、紊乱、断裂，肌间质水肿、增宽，心肌细胞出现凋亡，伤后时间越长，心肌损伤越重；而给予SAHA处理后，心肌损伤较烫伤组明显减轻, 肌纤维排列较整齐,间质水肿减轻，心肌细胞凋亡数量减少，说明SAHA能在一定程度保护心肌结构完整，保护心脏功能，抑制心肌细胞凋亡(图1)。

图1 各组心肌组织TUNEL染色(×400)

2.4 心肌细胞凋亡率 烫伤后3、6 h，烫伤组心肌细胞凋亡率[(16.1±0.8)%，21.5±1.2)%]明显高于假烫组[(0.5±0.1)%]，具有统计学意义(均P<0.05)；随伤后时间增加，心肌细胞凋亡率也随之升高，而给予SAHA处理后，心肌细胞凋亡率[(11.6±0.6)%，(15.1±0.9)%]较烫伤组明显降低(均P<0.05)。

2.5 心肌组织caspase-3活性 与假烫组[(0.435±0.041)μmol/mg]比较，烫伤组伤后3.6 h心肌组织内caspase-3活性[(0.716±0.052)μmol/mg，(0.912±0.063)μmol/mg]明显升高(均P<0.05)，而SAHA组caspase-3活性[(0.557±0.052)μmol/mg，(0.535±0.034)μmol/mg]显著低于烫伤组，组间比较差异具有统计学意义(均P<0.05)。

3 讨 论

严重烧伤/失血性休克后，心肌早期就出现缺血缺氧性损伤，心脏功能减退，进而诱发或加重休克。早期心肌损伤的防治对休克的治疗和减少并发症具有重要意义。对不能及时得到系统治疗的严重烧伤/失血性休克患者，如果在早期给予抗休克维持药物，保护休克状态下的心肌组织及心脏功能，对后续治疗意义重大。

以往研究证实，在严重烧伤早期就已出现心肌损伤[2]，由于烧伤部位血管通透性增加，血浆大量渗出至体外或第三间隙，有效循环血量锐减，导致心肌细胞缺血缺氧、能量代谢障碍、炎性反应、心肌细胞水肿、心肌结构受损及心功能下降等一系列反应，加重休克甚至死亡。

SAHA作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，以往研究证实组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有增加组蛋白的乙酰化水平，维持乙酰化动态平衡，具有促进基因转录、染色体重建、影响细胞分化、细胞保护、抗氧化、抗炎等作用[8-11]。烧伤后在心肌中，缺血、缺氧通过组蛋白H3/H4去乙酰化诱导组蛋白去乙酰化反应，组蛋白去乙酰化酶抑制剂能降低机体对缺血、缺氧性损伤的反应，在某种程度上阻断了缺血缺氧诱导的基因程序的激活[12]。本实验通过建立50%三度烫伤大鼠模型，观察SAHA对心脏功能的影响，大鼠在致死性烫伤伤后，烫伤组CK-MB水平显著升高，心肌组织含水率明显增加，心肌水肿，心肌结构紊乱、断裂，组织间隙水肿加重，而给予SAHA处理后，CK-MB水平较烫伤组明显降低，心肌细胞水肿减轻，心肌纤维排列紊乱情况明显好转，说明SAHA能在一定程度上保护心肌功能，减轻心肌细胞水肿，保护心肌结构完整。

在缺血、缺氧诱导心肌损伤过程中，早期出现心肌细胞凋亡，影响心脏功能。沈帆等[13]证实，SAHA通过抑制氧化应激改善间歇性低氧小鼠的心肌损伤。Nagata等[14]证实，SAHA通过诱导心肌内热休克蛋白表达，改善心脏功能，延缓心肌梗死后心力衰竭的发展。Yang等[15]证实，在小鼠缺血再灌注损伤模型中，SAHA可预防缺血再灌注引起的心肌内线粒体功能障碍和丢失，并减少缺血前后心肌ROS的产生，保护心脏功能。Caspase-3活性增加表明细胞出现凋亡，是细胞凋亡的重要检测指标。在本实验中，烫伤后心肌细胞出现凋亡，随伤后时间增加，心肌细胞凋亡数量持续增加，而caspase-3活性也显著升高，而给予SAHA治疗后，心肌细胞凋亡数量明显减少，caspase-3活性明显降低。本研究表明， SAHA能保护致死性烫伤大鼠心脏功能，可能与抑制心肌细胞凋亡、caspase-3活性有关。

综上所述，本实验通过SAHA对50%TBSAⅢ度烫伤大鼠心脏功能的影响研究，证实SAHA能保护致死性烫伤大鼠心脏功能，降低CK-MB水平，减轻心肌组织水肿，其作用机制可能与降低心肌组织内caspase-3活性、抑制心肌细胞凋亡有关，但具体机制有待进一步研究。