品质异常奶粉中芽孢杆菌的分离和鉴定

孙鹏亮，潘姣姣，陈荟旭，张秋林，魏鑫豪，李莲瑞*

（1．塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300；2．塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

芽孢杆菌是一种好氧或兼性厌氧的能产生极强抗逆性芽孢革兰氏阳性菌，芽孢对高温、高压、紫外线、干燥、电离辐射和酸碱剂都有很强的抗性。芽孢杆菌同时也是奶粉中常见的污染菌，严重影响着产品品质。耐热芽孢杆菌能够产生多种酶类。酶的形成会导致食品的感官品质发生改变及营养价值降低。奶粉受微生物污染的主要途径是奶粉特殊的加工工艺。奶粉在加工前，原料乳需要在乳罐中储存数小时或数天，不会立即进行巴氏消毒或者加工，在这种状态下过长时间会引起细菌的大量增殖[1]。因此，原料乳在加工前都要经过初次消毒，即将牛乳加热到63～65 ℃、15 s，以达到杀死部分细菌和抑制细菌酶活性的目的[2]。经过首次消毒后，附着在热交换器中部分未被杀死的嗜热芽孢杆菌依然存在增殖的可能性，嗜热芽孢杆菌的增殖则会对后续需要进行初次消毒的原料乳造成二次污染[3]。巴氏消毒乳在较长时间的贮藏和冷藏运输过程中，都极易受到微生物污染进而导致产品变质，其中对品质影响较大、延长货架期的微生物主要有嗜冷芽孢杆菌和嗜热芽孢杆菌[4]。耐热嗜冷芽孢杆菌孢外存在的耐热蛋白酶经过巴氏消毒工艺处理后，会发生蛋白酶分子重叠的现象[5]。该酶在低温贮存过程中逐渐被激活，在后续的乳制品储藏过程中，会使乳制品中的蛋白质和脂肪分解，最终导致产品发生变色、异味、凝固、发黏等变质现象，直接影响产品有效期[6]。本试验从品质异常奶粉中分离芽孢杆菌，并对其进行一系列的鉴定，以期找到污染乳制品的芽孢杆菌。

1 材料与方法

1.1 样品采集

品质异常奶粉批号20190516，生产日期2019年5月17日，由南疆某乳品企业提供，4 ℃保存备用。

1.2 试剂与仪器

试验试剂：95%乙醇溶液、结晶紫溶液、碘液、0.5%的番红花红乙醇溶液、1%氢氧化钠溶液、饱和孔雀绿溶液；DNA提取试剂盒（M10208）、胶回收试剂盒（L41118）购自北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；pMD-19T载体购自TAKARA公司。

试验仪器：恒温培养箱、高压锅、小型台式高速离心机、小型高速冷冻离心机、微波炉、洁净工作台、显微镜、水浴锅、摇床等。

1.3 试验方法

1.3.1 品质异常奶粉中芽孢杆菌的筛选、分离、纯化

取样：在洁净工作台上无菌操作，取3 g奶粉样分装到无菌细菌瓶中，加入10 mL无菌蒸馏水，涡旋混匀样品。

接种：将混匀的样品置于80 ℃水浴20 min，取水浴后的样品1 mL于无菌的EP管中，用无菌蒸馏水倍比稀释5个梯度，涂布法分别接种于锰盐营养琼脂、普通营养琼脂和嗜冷菌计数琼脂，锰盐营养琼脂于55 ℃培养，普通营养琼脂于37 ℃培养，嗜冷菌计数琼脂于4 ℃培养。倒置培养，锰盐营养琼脂和普通营养琼脂培养24～48 h，嗜冷菌计数琼脂培养5～7 d后观察结果。

纯培养：对培养出来的菌落进行形态观察，选取形态不同的单菌落，在对应的培养基上进行分离培养和纯培养。

细菌抹片的制备：在干净的载玻片上加10 μL无菌生理盐水，接种环挑取纯化的单菌落均匀涂布于生理盐水中，自然晾干或酒精灯外焰烘干固定。

染色：对细菌涂片进行革兰染色和芽孢染色。

镜检：油镜下观察菌体特征和有无芽孢。

选取镜检有芽孢的单菌落，接种到装有10 mL液体培养基的细菌瓶中摇菌扩增，用于DNA提取。

菌种的保存：将分离得到的细菌在最适温度下进行培养，将对数末期时的菌液与经过消毒的50 %甘油溶液按1∶1比例混合均匀，冻存于-20 ℃和-70 ℃冰箱，防止菌种丢失。

1.3.2 品质异常奶粉中芽孢杆菌DNA的提取

将在液体培养基中过夜培养的细菌取1 mL加到无菌1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃上清，重复1次，收集适量细菌。细菌DNA提取方法按照北京全式金生物技术有限公司DNA提取试剂盒（M10208）说明书进行操作。提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.3.3 品质异常奶粉中芽孢杆菌16S rDNA扩增

细菌通用引物序列如下：27F：5'-AGAGTTT GATCCTGG CTCAG-3'和1492R：5'-CGGTT ACCTTGTT ACGACTT-3'进行PCR扩增。PCR扩增体系为：DNA模板1 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、EasyTaq SuperMix 12.5 μL、加入ddH2O补至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察是否有目的条带。

1.3.4 品质异常奶粉中芽孢杆菌16S rDNA的克隆和鉴定

1.3.4.1 PCR产物切胶回收

按照北京全式金生物技术有限公司胶回收试剂盒（L41118）说明书进行操作，回收的DNA于-20 ℃保存备用。

1.3.4.2 目的基因和pMD-19T载体连接与pMD-19T载体自连

回收的16S rDNA片段0.5 μL、pMD-19T载体3.5 μL、Solution I 6 μL于1.5 mL离心管，ddH2O 0.5 μL、pMD-19T载体3.5 μL、Solution I 6 μL于另一1.5 mL离心管，置于16 ℃连接过夜。

1.3.4.3 连接产物的转化

将连接物10 μL加入100 μL感受态DH5α中，冰浴30 min，42 ℃热冲击90 s，再置冰浴1 min，加入含Amp+（50 mg/L）的LB液体培养基800 μL，37 ℃、180 r/min振荡培养1 h，取转化菌100 μL涂布于含有Amp+（50 mg/L）的琼脂平板培养基上，培养12 h，长出单菌落，挑取单菌落，于含Amp+（50 mg/L）的LB液体培养基中过夜培养。

1.3.4.4 质粒电泳鉴定和质粒的PCR鉴定

质粒提取按照质粒小提试剂盒说明书进行操作，质粒DNA溶液于1.5 mL离心管中保存备用。

16S rDNA质粒DNA10 μL与pMD-19T载体自连质粒DNA对照，经1%琼脂糖电泳后，观察条带大小。用提取的16S rDNA质粒DNA做PCR模板，用通用引物进行扩增后，以pMD-19T载体自连质粒DNA做PCR模板为阴性对照，经1 %琼脂糖电泳后，观察条带大小。

1.3.5 测序

选取鉴定后的阳性克隆，提取质粒DNA，送测序。

1.3.6 序列分析

测序所得的序列在NCBI上进行核苷酸序列比对，鉴定该细菌的种属。

2 结果与分析

2.1 品质异常奶粉中芽孢杆菌的筛选、分离、纯化结果（见图1、图2）

由图1可知，分离得到外观扁平、边缘不整齐、白色，表面粗糙皱褟的单菌落。由图2可知，分离得到外观呈白色蜡状，形态为边缘整齐、凸起、表面干燥、有皱褶的单菌落。

2.2 品质异常奶粉中芽孢杆菌的染色结果（见图3、图4）

将图1、图2中的单菌落制作抹片后，进行革兰染色。

由图3可知，经革兰染色后，菌体被染成蓝紫色，芽孢不着色。

由图4可知，经孔雀石绿-沙黄染色法进行芽孢染色后，菌体被染成红色，芽孢呈绿色。

2.3 品质异常奶粉中芽孢杆菌的16S rDNA扩增结果（见图5）

细菌基因组DNA提取以后，用细菌通用引物扩增以后，PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳结。

由图5可知，16S rDNA扩增成功，大小为1 500 bp左右，与预期大小一致。

2.4 品质异常奶粉中芽孢杆菌16S rDNA质粒电泳结果（见图6）

品质异常全脂灭菌乳中芽孢杆菌的16S rDNA的克隆菌和pMD-19T载体自连的克隆菌放在含Amp+（50 mg/L）的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒后，经1%琼脂糖凝胶电泳。

由图6可知，芽孢杆菌的16S rDNA的质粒和pMD-19T载体自连的质粒大小不同，与预期一致。

2.5 质异常奶粉中芽孢杆菌16S rDNA质粒PCR鉴定的电泳结果（见图7）

品质异常全脂灭菌乳中芽孢杆菌的16S rDNA的克隆菌放在含Amp+（50 mg/L）的LB液体培养基中过夜培养，提取质粒后，以质粒DNA为模板，用细菌通用引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳。

由图7可知，以质粒为模板，且扩增出大小为1 500 bp左右的目的条带。

2.6 品质异常奶粉中芽孢杆菌的16S rDNA的序列分析结果（见表1）

表1 异常奶粉中芽孢杆菌序列比对结果Tab.1 Sequence comparison results of Bacillus in abnormal milk powder

由表1可知，测序后的序列经NCBI blast在线比对后确定3株短小芽孢杆菌及7株地衣芽孢杆菌。

2.7 地衣芽孢杆菌系统发育树的构建及分类（见图8、图9）

由图8、图9可知，将其结果提交到NCBI数据库进行核酸比对，建立进化树后分析表明，该菌株与登录号 为 KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢杆菌处于同一分支，且根据同源性分析，该菌株与登录号为KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢杆菌同源性为100%。根据上述结果，可以确定该菌株为地衣芽孢杆菌。

2.8 短小芽孢杆菌系统发育树的构建及分类（见图10、图11）

由图10和图11可知，将其结果提交到NCBI数据库进行核酸比对，建立进化树后分析表明，该菌株与登录号为 FJ641024、MT367713、FJ641028、KU662344、DQ275671、KR780437、KF463141的短小芽孢杆菌处于同一分支，且根据同源性分析，该菌株与登录号为FJ641024、MT367713、FJ641028、KU662344、DQ275671、KR780437、KF463141的短小芽孢杆菌同源性为100 %，根据上述结果，可以确定该菌株为短小芽孢杆菌。

3 讨论

奶粉中芽孢杆菌的研究较多，特别是婴儿配方奶粉。郑艺[7]从污染的婴儿配方奶粉中分离出的微生物为地衣芽孢杆菌。蔡彦希[8]对市面上出售的29批婴儿配方奶粉进行微生物调查，发现污染微生物中芽孢杆菌占72%，其中地衣芽孢杆菌占34.5%。Murphy等[9]从奶粉中分离到地衣芽孢杆菌。Hill等[10]从11个不同工厂相同季节季的244个新西兰市售乳粉样本中分离芽孢杆菌，发现有地芽孢杆菌的污染，且是优势菌株。王林林[11]从成品乳粉中分离细菌发现有地衣芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的污染。但在奶粉中研究更多的是能产生毒素的蜡样芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌是嗜热菌，产生的毒素为呕吐毒素或腹泻毒素，国内外也出现过多例消费者使用受蜡样芽孢杆菌的乳品出现呕吐或腹泻的案例，该菌危害较大。赵月明[12]进行乳品中蜡样芽孢杆菌暴露研究，发现巴氏消毒乳中蜡样芽孢杆菌的污染最严重，其次是发酵乳、奶粉和UHT乳。王伟军等[13]对市售的多种奶粉进行芽孢杆菌污染调查，其中也有蜡样芽孢杆菌污染的奶粉。乳粉中的芽孢杆菌大多数是休眠体的芽孢，因为乳粉环境不适合芽孢杆菌生长繁殖，乳粉里的芽孢能长期存在并保持萌发的能力，待条件满足生长的时候，芽孢可能被激活并萌发生长。Brosius等[14]从90年前的奶粉中分离出来枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的活芽孢。Hill等[10]研究发现，奶粉厂中嗜热杆菌产生的芽孢比实验室培养基产生的芽孢更耐热，污染乳品的大多数芽孢杆菌都能产生蛋白酶、脂肪酶等，其中一些嗜冷菌产生的脂肪酶耐热性极高，即使菌体被杀灭，但其代谢产物仍能污染奶粉使之腐败变质等。奶粉中芽孢在乳粉被人们用开水或热水溶解的时候可能被激发，若没有及时饮用，搁置一段时间，里面的芽孢杆菌就会快速生长繁殖，可能会引起饮用者食物中毒。短小芽孢杆菌的研究较少，除了加强原料乳中芽孢杆菌的监测，还应加大对乳品加工车间及加工生产设备的清洗消毒。

本试验从异常奶粉中分离鉴定出3株短小芽孢杆菌和7株地衣芽孢杆菌。对地衣芽孢杆菌进行进化树的构建结果显示，该菌与登录号为KU986668、CP025226、MK063874、MN493780、MG97702的地衣芽孢杆菌处于同一分支，且同源性为100%。根据上述结果，可以确定该菌株为地衣芽孢杆菌。对短小芽孢杆菌进行进化树的构建结果显示，该菌株与登录号为FJ641024、MT367713、FJ641028、KU662344、DQ275671、KR780437、KF463141的短小芽孢杆菌处于同一分支，且同源性为100%。

4 结论

本试验从品质异常奶粉中分离得到7株疑似地衣芽孢杆菌、3株疑似短小芽孢杆菌。通过对10株芽孢杆菌的16S rDNA序列克隆后测序，并将16S rDNA序列进行进化树构建和同源性分析，分离得到的7株疑似地衣芽孢杆菌和3株疑似短小芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。