蛋白质免疫印迹快速测定猪肺炎支原体抗原含量

车巧林，胡 芳，沈晓红，董彦鹏，靳蒙蒙

（江苏南农高科技股份有限公司，江苏 江阴 214400）

猪肺炎支原体（mycoplasma hyopneumoniae）可引起猪地方流行性肺炎，俗称气喘病。该病以咳嗽和气喘为主要临诊症状，不同年龄猪群均易感染[1]，剖检变化为肺的尖叶、心叶和隔叶呈对称性的虾肉样病变。猪肺炎支原体感染导致猪的生长受阻，饲料转化率降低，机体免疫能力降低，导致免疫抑制[2]。

猪肺炎支原体的抗原主要由蛋白质与脂质组成，其中蛋白是产生免疫反应的主要免疫原之一[3]。P46是猪肺炎支原体的细胞膜表面抗原蛋白，可引起宿主早期免疫应答反应。P46在种内保守性高。熊焰等[4]对MY99株进行连读的人工传代后，发现P46仍然具有很好的稳定性和免疫原性。P46蛋白与猪鼻支原体、猪滑液支原体和猪絮状支原体等病原体之间无交叉反应，且能在猪肺炎支原体感染后两周内检测到相应的抗体[5]。因此，P46常常被用在诊断试剂的开发研究中。Bouh等[6]利用p46蛋白制备的单克隆抗体建立用于检测猪肺炎支原体的ELISA方法，该方法具有良好的特异性和敏感性。本研究应用P46单抗作为“探针”抗体先建立猪肺炎支原体不同CCU含量的蛋白免疫印迹（Western blot，WB）图谱，然后测定不同批次的猪肺炎支原体抗原CCU含量，并与WB图谱测定的CCU进行比较，以建立一种猪肺炎支原体抗原含量快速测定的方法。

1 材料与方法

1.1 菌种

猪肺炎支原体HN0613株由江苏南农高科技股份有限公司鉴定和保存。

1.2 试剂及仪器

Friis基础液、Friis培养基由江苏南农高科技股份有限公司自制；2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA）购自Sigma Aldrich公司；无水硫代硫酸钠购自Alfa Aesar公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、5×上样缓冲液购自碧云天公司；预染Marker、显色底物液购自THERMO公司；丽春红购自Sigma公司；HRP-羊抗鼠IgG购自武汉博士德公司。

MiniPROTEANTetra Cell电泳仪、VE-186转印仪购自Bio-Rad公司；5200化学发光仪购自Tanon公司；5810 R高速离心机购自Eppendorf公司；JN-02C高压均质破碎仪购自广州聚能JNBIO公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自GE Healthcare公司。

1.3 猪肺炎支原体菌液的制备

猪肺炎支原体HN0613株F6代冻干菌种用2 mL Friis培养基溶解，以10%比例接种于含20 mL Friis培养基的100 mL盐水瓶中，37 ℃恒温培养至pH值6.7～6.8时收获。收获的菌液以5%比例接种传代2次，120 r/min、37℃恒温振荡培养，pH值降至6.7～6.8时收获，收获菌液进行纯粹检验及CCU测定。

1.4 猪肺炎支原体抗原含量CCU测定

将待检菌液用Friis液体培养基作10倍系列稀释，即0.2 mL待检菌液加入装有1.8 mL Friis液体培养基的西林瓶中混匀，连续稀释成10-1至10-12，并设培养基对照，每个待检样品的各稀释度分别做2个重复。37 ℃培养2周，每日观察培养基颜色变化，在培养基对照颜色不变的条件下，记录待检稀释菌液颜色变黄的最高稀释度，取2个重复的平均值为CCU滴度。

1.5 不同CCU含量的猪肺炎支原体抗原蛋白免疫印迹

1.5.1 猪肺炎支原体抗原蛋白处理

猪肺炎支原体抗原300 mL（可以是活抗原，也可以是灭活抗原）10 000 r/min、4 ℃离心1 h，弃上清，用1/15 mol/L、pH值7.2的PBS重悬沉淀，10 000 r/min、4 ℃离心1 h，弃上清，用30 mL、1/15 mol/L、pH值7.2的PBS重悬沉淀。重悬抗原用高压均质破碎仪在1 000 W功率下连续破碎2～3次至破碎液澄清透亮，破碎液10 000 r/min离心15 min，取上清备用。根据CCU测定结果将10倍浓缩的抗原蛋白分别稀释为1×1010、5×109、1×109、5×108、1×108、5×107、1×107、1×106CCU/mL。

1.5.2 SDS-PAGE

采用垂直板型不连续凝胶电泳系统，分离胶为10%，浓缩胶为5%制备2块凝胶。取100 μL不同CCU滴度的抗原蛋白，加入25 μL 5×上样缓冲液，混匀，沸水煮10 min，25 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液进行SDS-PAGE。电压调至90 V，电泳25 min，待蛋白条带跑至分离胶时，将电压调至120 V直至电泳结束。取一块凝胶进行考马斯亮蓝R250染色检测，另一块凝胶不染色进行转膜。

1.5.3 转印

将未染色的凝胶、裁减好的NC膜夹于滤纸之间，按照负极-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-正极的顺序放入装有电转液的电泳槽，200 mA恒流转印80 min。转印结束后，放入丽春红染色液中染色1～2 min，用铅笔标记出泳道和Marker条带大小，PBS洗去丽春红染液。

1.5.4 Western blot

NC膜清洗干净后，放入5%脱脂乳PBS中4 ℃过夜封闭，TBST洗涤2次，5 min/次。加入1∶1 000稀释的猪肺炎支原体P46单抗，室温孵育2 h，TBST洗涤5次，再加入1∶2 000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，TBST洗涤5次，化学发光试剂盒显色10～60 s，化学发光仪显影0.1～10 s，拍照。

1.6 猪肺炎支原体抗原灭活前后Western blot对比

100 mL猪肺炎支原体菌液经终浓度0.4 mmol/L的BEI灭活24 h，10 mmol/L硫代硫酸钠终止1 h，灭活检验合格后，灭活菌液和未灭活菌液高速离心后，沉淀用1/15 mol/L、pH值7.2的PBS洗涤1次，然后用原体积量的PBS重悬，高压均质破碎后离心取上清备用。灭活菌液、未灭活菌液和 1×108、5×108、1×109、5×109CCU/mL的猪肺炎支原体标准抗原蛋白同时进行Western blot分析。

1.7 猪肺炎支原体抗原CCU测定与Western blot测定的比较

50、100和500 L发酵罐培养的多批次猪肺炎支原体抗原用CCU法和Western blot法分别测定CCU。为减少误差，CCU法测定时每批次抗原测定4个重复，最后取4个重复的平均值为最终CCU；Western blot法测定CCU时根据标准蛋白对应的CCU进行判定。

2 结果与分析

2.1 不同CCU含量的猪肺炎支原体抗原蛋白免疫印迹

猪肺炎支原体抗原含量测定结果为109CCU/mL。菌液经10倍浓缩、洗涤、高压均质破碎，用PBS稀释为不同CCU含量的猪肺炎支原体抗原蛋白，经SDSPAGE分离后，5×109CCU/mL以上的抗原蛋白在电泳图谱上可以显示出条带，约11条带，相对分子质量范围在15～130 kD，电泳图谱见图1。

不同CCU含量的猪肺炎支原体抗原蛋白免疫印迹图谱见图2。由图2可知，曝光3 s，5×107CCU/mL含量以上的抗原在46 kD处有条带，且条带粗细、明暗程度随着CCU含量的增高而增高；107CCU/mL的抗原蛋白显示不出条带，说明抗原含量太低，免疫印迹检测不到。

2.2 猪肺炎支原体抗原灭活前后Western blot对比（见图3）

由图3可知，在46 kD处均有一条带。这两条带粗细一样，且与109CCU/mL的猪肺炎支原体标准抗原蛋白条带粗细一样，说明Western blot可用于测定猪肺炎支原体灭活抗原的含量，且不受灭活剂BEI的影响。

2.3 猪肺炎支原体抗原含量CCU测定与Western blot测定结果的比较（见表1、图4）

由表1可知，7批抗原中有3批抗原（50L-009、100L-009、500L-009）2种方法测定的CCU结果一致；2批抗原（100L-007、500L-007）测定的CCU结果基本吻合；2批抗原（100L-010、500L-010）测定的CCU结果有差异，但差值在1.5～5.0倍，可能是由于培养时间长导致的。CCU法测定的是活菌的含量，WB法测定的是包括活菌和死菌在内所有菌的含量，因此如果猪肺炎支原体培养时间过长，导致部分支原体死亡，WB法测定的抗原含量要比CCU法测定的结果高。

表1 猪肺炎支原体抗原含量CCU法和WB法测定结果的比较Tab.1 Comparison of the results of CCU method and WB method for the content of M. hyopneumoniae antigen

3 讨论

支原体抗原含量测定通常采用颜色改变单位法（color change unite，CCU）或菌落形成单位（colonyforming units，CFU），由于支原体的培养条件要求相比细菌要严格得多，大部分种类在固体培养基上很难形成典型菌落。即便形成菌落，菌落也很微小，难于统计，因此CCU成为最常用的支原体活菌滴度测定指标。半数变色单位CCU50测定方法可以提高支原体含量测定的准确性。该方法最早由Masover等[7]使用，但描述非常简略。随后Robertson等[8]对该方法的具体稀释进行详细描述，之后Robertson等[9]和Stemke等[10]使用人型支原体和解脲支原体对CFU和CCU50的测定结果与核酸浓度进行相关性比较，发现CCU50与核酸浓度相关性更好。沈青春等[11]在Masover等使用的CCU50基础上，借鉴病毒滴度TCID50的标准测定方法，将其改进后用于支原体的活菌滴度测定，重复性良好，具有较强的敏感性和适用性。CCU和CCU50法测定周期长，容易受到培养基、器皿洁净度、操作中人为因素的影响。因此，出现利用活细胞含有一定量ATP，死亡细胞ATP很快分解消失的特性测定的ATP荧光法。Stemke等[10]通过荧光素酶-荧光素方法测定细胞中ATP的含量，实现对猪肺炎支原体和絮状支原体活菌数的快速测定。Calus等[12]利用ATP荧光法测定猪肺炎支原体培养物的活菌数，并用其绘制生长曲线。ATP荧光技术具有快速、方便的特点，但对样品处理、检测仪器精度和稳定性等有较高要求，使应用受到一定限制。上述方法只能检测培养收获的活支原体的含量，不能准确反映经后续工艺处理后疫苗中支原体抗原的实际含量，因此更适合活疫苗产品的质量评价。

近年来先后出现紫外测定法和PCR法等快速测定支原体培养物菌体滴度的方法。紫外检测法具有简单、快速、精确的特点，是一种较多用于微生物大规模培养中对培养物菌数进行测定的方法。该方法的缺陷是测定的结果培养物中所有的核酸浓度，包括死亡和老化，若有污染，还包括污染微生物的核酸，甚至包括培养物中添加物的核酸成分[11]。猪肺炎支原体培养基成分中含有核酸，因此该紫外检测法不适用于猪肺炎支原体的测定[11]。PCR法虽具有快速、特异性强、重复性好的特点，但是模板提取很关键。猪肺炎支原体由于个体小，且培养困难，培养菌液按照常规的核酸提取方法不能保证每次提取成功，且PCR中容易出现假阳性和假阴性现象，因此该方法用于猪肺炎支原体灭活疫苗抗原含量的测定也具有一定的缺陷性。

蛋白质印迹（Western blot）是生物学领域最重要的支撑技术之一，在蛋白质以及蛋白质组学研究中有广泛的应用，主要借助抗体的特异性调查蛋白质的表达丰度特征[13]。该技术的原理是样品总蛋白经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）被分离，再将SDSPAGE胶上的蛋白质信号转移到固体支持膜（目前常用的是NC膜或PVDF膜）上，然后使目标蛋白质与其特异性一抗抗体（称为“探针”抗体）在膜上结合，形成目的蛋白与一抗的复合物，再与标记的能识别特异性抗体的种属特异性抗体（酶标二抗）结合，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光，检测有无特异性蛋白条带出现，也可通过条带的密度大小进行特异性蛋白的半定量。Burnette等[14]采用此方法对抗体和放射性碘标记的蛋白A进行检测，并将该方法称为 Western blot。熊仁平等[15]探究免疫印迹法在测定蛋白质含量方面的应用，建立一项用蛋白免疫印迹法测定鸟苷酸结合蛋白（G蛋白）含量的技术。目的蛋白的上样量是蛋白免疫印迹半定量在药理研究中的主要影响因素。在能获得条带质量较好的前提下，改变上样体积和抗体孵育时间、适当稀释抗体和发光液浓度不但不影响试验结果，反而有利于试验[16]。可见，控制好样品上样量可以通过蛋白免疫印迹对目的蛋白进行半定量测定。

本研究通过制备不同CCU含量的猪肺炎支原体抗原蛋白，然后进行Western blot，建立猪肺炎支原体抗原CCU含量与抗原蛋白含量免疫印迹图谱之间的关系，之后对车间生产的抗原用CCU测定法和免疫印迹法同时测定抗原含量，两种方法测定的结果误差在5倍以内。因此，可以将免疫印迹方法作为灭活疫苗抗原生产质量控制的补充因素。免疫印迹法与CCU测定法相比，具有一定的优越性：第一，猪肺炎支原体抗原含量检测周期缩短12 d；第二，如果CCU检测结果出现误差需要重检时，样品可能因为保存时间过长（超过10 d）活菌数大大下降、无法重检；而免疫印迹法样品已经处理为蛋白，相对活菌来说，蛋白的保存时间明显延长，因而可以重检。另外，如果需要测定更精确的猪肺炎支原体抗原含量，可以在免疫印迹图谱建立时降低标准抗原蛋白稀释间隔获得更精准含量的蛋白图谱。

4 结论

蛋白质免疫印迹分析可用于猪肺炎支原体抗原含量的快速测定。