比较益生菌和中药组合对鸡源大肠杆菌抑菌效果分析

史雪坤，王慧青，苗天姿，高 乐，张东远，汪恩强*

（1．河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001；2．中国科学院天津工业生物技术研究所天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，天津 300308；3．中科康源（唐山）生物技术有限公司，河北 唐山 063000）

大肠杆菌引起的鸡输卵管炎导致蛋鸡产蛋率严重下降和种鸡散发性死亡。鸡输卵管炎病因复杂，易反复发作，慢性表现为输卵管膨胀、管壁变薄、有干酪样渗出物，对蛋鸡饲养业的危害较大[1]。研究发现，益生菌和中药对鸡源大肠杆菌有一定的抑菌效果。

益生菌分为芽孢杆菌类、酵母菌类和乳酸菌3大类。常用的益生菌有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、酿酒酵母菌和凝结芽孢杆菌等[2]。益生菌具有增强消化能力、减少应激、增强机体免疫力和预防疾病等功能[3]。益生菌能产生抑菌作用的一部分原因是细菌在新陈代谢中产生具有拮抗作用的多肽类物质，一般为抗菌肽[4]。

中药抗菌副作用小、不易产生耐药性[5]。中草药的抑菌机制主要通过影响蛋白合成过程和中药中具有抗菌活性的成分干扰细胞壁的发育[6]。近些年，越来越多的中药抗菌活性成分被不断提取出来，包含多糖类、黄酮类、挥发油类、生物碱类和有机酸类等化合物[7]。大部分具有清热解毒和抗炎作用的中药材都具有抑菌作用[8]。研究表明，黄连内含有生物碱、香豆素、多糖等，生物碱类物质比重最大，发挥作用的化合物是小檗碱，具有抗菌、消炎、 抗肿瘤等药理活性[9-10]。

本试验选用3种益生菌和6种中药组合（黄连、茯苓、赤芍、金银花、鱼腥草、桂枝），通过牛津杯扩散法测定对鸡源大肠杆菌的抑菌效果，对抑菌机理进行解析，为开发抗生素替代物质研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

从鸡输卵管液中分离出来大肠杆菌、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisKS-01）、植物乳杆菌（Lactobacillus phantarumLB-04）、地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformisBL-03）由中科康源（唐山）生物技术有限公司提供。

1.1.2 试验试剂

DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自天津生化科技有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂粉、氢氧化钠均为分析纯，购自天津市化学试剂厂；黄连、茯苓、赤芍、金银花、鱼腥草、桂枝均在当地市场购买；肠杆菌肽标准品购自北京百灵威科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

超净工作台（SJ-CJ-1FD）购自苏洁医疗器械有限公司产品；恒温水浴锅（HH-8A）购自北京科伟永兴仪器有限公司产品；37 ℃隔水恒温培养箱（6MP-9080）购自上海精宏实验设备有限公司；恒温振荡器（THZ-C）购自苏州培英实验设备有限公司；pH计（PHS-2F）购自雷磁仪电科学仪器有限公司；搅拌器（JB-1A）购自雷磁上海精科有限公司；低速离心机（KDC-40）购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；PCR仪（K960）购自力康生物医疗科技控股有限公司；琼脂糖水平电泳仪（DYCP-31DHDYY-6C）购自北京六一生物科技有限公司；凝胶成像仪（JS-680D）购自上海培清科技有限公司；液相色谱仪（Agilent 1260）购自天津远大科仪科技发展有限公司。

1.1.4 培养基

胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠10 g，用5 mol/L的NaOH调pH值至7.0～7.2。LB固体培养基在液体培养基的基础上加入1.5%～2.0%的琼脂粉。所有培养基均在121 ℃、1×105Pa灭菌 20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 样品细菌分离

取1 mL的鸡输卵管液中分离细菌和9 mL的无菌双蒸水混匀，梯度稀释后，吸取200 μL 10-4和10-5浓度的样品稀释液，均匀涂布于LB固体培养基，静置1 h，倒置于37 ℃培养24 h，待菌落长出以后纯化培养。选取单菌落接种至5 mL LB液体培养基中，250 r/min 37 ℃摇床中过夜培养。

1.2.2 细菌鉴定

提取细菌基因组：取1.5 mL培养菌液，5 000 r/min离心10 min，无菌水洗涤1次，900 μL无菌双蒸水重悬，加入8 μL浓度为50 mg/L的溶菌酶溶液，放入37 ℃培养箱保温20 min；加入10 μL 10%的SDS溶液，放入37 ℃培养箱保温30 min；加入10 μL浓度为20 mg/L的蛋白酶K，放入37 ℃培养箱保温60 min；加入等体积的苯酚，氯仿，异戊醇（25∶24∶1），振荡混匀，10 000 r/min离心5 min，收集上清液；在上清液中加入1/5体积的醋酸钠，2倍体积的冷无水乙醇，沉淀DNA。用70%的乙醇洗涤，室温下干燥30 min，最后加入50 μL无菌双蒸水溶解。

反应体系：PCR mix 25 μL、模板DNA 1 μL、引物1和2各0.4 μL、无菌双蒸水23.2 μL、总体积为50 μL。反应条件：预变性95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，54 ℃、30 s，68 ℃、90 s，重复循环35次，72 ℃延伸9 min。凝胶回收送样测序检测后，利用NCBI BLAST功能，将测序结果与GenBank已收录的基因组DNA序列进行比对。

1.2.3 益生菌和中药的筛选

采用牛津杯定量扩散法通过测定抑菌圈直径评价多种益生菌和中药对鸡源大肠杆菌的抑菌效果。牛津杯高压灭菌后置入无菌平板，倒入LB培养基，静置30 min，等到培养基凝固后取出。吸取200 μL指示菌液均匀涂布至LB固体培养基上，注意不要涂到牛津孔内，将平板正置1 h后，分别在孔内加入200 μL益生菌发酵液和中药煎煮液置入37 ℃培养箱培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.2.4 肠杆菌肽的测定

选用抑菌效果明显的枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌接种至LB液体培养基中，在37 ℃转速为250 r/min的摇床中培养48 h，8 000 r/min离心30 min，留取上清液。上清液用Millpore超滤离心管超滤浓缩后（截留分子量为3 000 kD）5 000 r/min离心，留取上清液，即为抗菌肽粗提取液。采用高效液相色谱法测定肠杆菌肽含量（ZORBAX 300SB-C8），分析发酵液浓缩液和肠杆菌肽标准品峰面积，计算出肠杆菌肽的含量。

2 结果与分析

2.1 鸡源大肠杆菌分离纯化与菌种鉴定

将鸡输卵管液分离培养纯化后的细菌基因组为模板，使用16 s通用引物进行PCR扩增，得到基因片段。琼脂糖凝胶回收后送样测序检测，利用NCBI BLAST功能，将测序结果与GenBank已收录的基因组DNA序列进行比对，该菌株与大肠杆菌E. coliRCB592的16 s RNA序列相似度达到99.3%，确定该鸡源菌株为大肠杆菌（E. coli）。以E . coliRCB592菌株作为指示菌。

2.2 益生菌对鸡源大肠杆菌抑菌效果分析（见表1、图1）

表1 3种益生菌对大肠杆菌RCB592平均抑菌圈直径（牛津杯直径为0.8）Tab.1 The average inhibition zone diameter of the three probiotics against E. coli RCB592 /cm (Oxford cup diameter is 0.8) 单位：cm

由表1、图1可知，地衣芽孢杆菌的加入，并无明显抑菌圈，无抑菌效果。枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌抑菌效果明显，且枯草芽孢杆菌的抑菌效果略优于植物乳杆菌。

2.3 中药材组合抑菌作用（见表2、图2）

表2 中药组合对大肠杆菌RCB592平均抑菌圈直径Tab.2 Pairwise combination of traditional Chinese medicines on E.coli RCB592 average inhibition zone diameter 单位：cm

本研究将6种中药采用两两组合方式，比例均为1∶1。由表2和图2可知，黄连和茯苓的抑菌效果最为显著，黄连和赤芍的抑菌效果最弱。

2.4 解析益生菌的抑菌机理（见图3）

以鸡源大肠杆菌E.coliRCB592为指示菌，益生菌的抑菌效果明显优于中药组合效果。主要是中药材中活性物质释放较慢，被鸡源大肠杆菌利用、发挥药效周期较长，所以中药材抑菌效果较为有限。益生菌（枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌）抑菌效果非常明显。为了解析益生菌的抑菌机理，将枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵液进行高效液相分析，发现在枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵液中检测到肠杆菌肽的存在。由图3可知，肠杆菌肽含量大约为27.68 mg/g和11.45 mg/g。

3 讨论

本试验比较益生菌和中药对大肠杆菌的抑菌效果，筛选出抑菌效明显的益生菌，并对其抑菌机理进行分析。胡仁火等[11]研究发现，黄连单独使用对大肠杆菌抑菌效果很差，抑菌率只有17%。本试验单独使用黄连无抑菌效果，但是黄连和其他中药联合使用效果较好。可能是黄连中具有抗菌活性的成分和其他中药的抗菌成分发生反应，起到药物之间的相加作用。黄连有较明显的抑菌效果是由于黄连中小檗碱的抗菌作用，小檗碱是一种广谱的抗生素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌作用，但是小檗碱对革兰氏阳性菌效果较好。中药组合对鸡源大肠杆菌有抑菌效果，但较为有限。中药抑菌成分多种多样，多种抑菌活性成分相互作用的机制研究还不透彻。确定中药材中发挥抑菌作用的成分需要体外试验和体内试验相结合才能得到更准确的结论。益生菌对大肠杆菌有非常明显的抑菌效果是由于发酵分泌产生具有抗菌活性的抗菌肽。目前，大约有3 000多种抗菌肽被分离出来，抗菌肽是宿主先天性防御系统中的重要组成部分[12]，不仅有强大的抑菌效果，还有抗病毒、抗寄生虫、调节机体免疫功能和抑制肿瘤等多种作用。白杰等[13]研究获得的枯草芽孢杆菌B3菌株，其产生的抗菌肽分子质量较小为1 567.86 Da，对E. coli具有高效的抑菌效果。庄国宏[14]在探究初步机理的研究中发现，枯草芽孢杆菌通过分泌的抗菌肽能够引起肠杆菌细胞膜穿孔，导致代谢活力下降及菌体破裂等，从而起到抑菌的效果。

由于益生菌发酵产生的抗菌肽具有不易产生耐药性、无毒副作用等优点，未来可以生产益生菌作为微生物菌剂，作为传统抗生素的替代品，可降低家禽发病率和致死率。

4 结论

本试验中检测到枯草芽孢杆菌肠杆菌和植物乳杆菌发酵液中有抗菌肽成分，其含量可以达到27.68 mg/g和11.45 mg/g。较高的抗菌肽产量是枯草芽孢杆菌肠杆菌和植物乳杆菌有明显抑菌效果的原因。