辣蓼黄酮对小鼠免疫功能调节作用的研究

谢映红，李 璐，肖 琦，于美玲，胡庭俊

（广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005）

辣蓼是蓼科蓼属一年生草本植物，味辛、温，具有祛风利湿、散瘀止痛、解毒消肿等功效[1]。辣蓼的主要成分有黄酮类、挥发油、鞣质类、脂肪酸、三萜类、糖苷、蓼酸等。黄酮类化合物是一类重要的植物次生代谢产物，普遍存在于天然植物的根茎叶及花果中，具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗心血管病、抗炎症等药理作用[2-4]。但关于辣蓼黄酮在免疫药理方面的研究报道较少。环磷酰胺（CTX）是临床上常用的细胞毒性化疗药物，其在杀伤肿瘤细胞的同时，可损伤机体的免疫器官，抑制机体的体液免疫和细胞免疫反应，造成免疫功能的低下[5]。本试验选用环磷酰胺作为抑制剂建立小鼠免疫抑制模型，旨在研究辣蓼黄酮正丁醇部分（FNB）对小鼠的免疫功能的调节作用，为辣蓼黄酮的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物

辣蓼黄酮正丁醇部分（FNB），FNB中黄酮含量为52.84%，由广西大学动物科学技术学院药理实验室提取。

1.1.2 试验动物

试验选用SPF清洁级别健康的5～6周龄昆明小鼠60只，雌、雄各半，体重18～22 g，生产许可证号为：SCXK桂2014-0002，购自广西医科大学实验动物中心。

1.1.3 试验饲料

SPF饲料由广西医科大学实验动物中心提供的小鼠全价饲料。

1.1.4 试验试剂

结晶紫溶液（天津富宇精细化工）、苦味酸（斯百全化学有限公司，货号：P1691）、中性树胶（上海国药集团，批号：20150730）、瑞士-姬姆萨染液（贝索Baso）、甲醛（成都市科龙化工试剂厂）、注射用环磷酰胺（安道生，0.2g/瓶/盒，批号：5K087A）、氯化钠（贵州天地药业公司，批号：H20033973）、无水乙醇（天津富宇精细化工有限公司）。小鼠溶菌酶试剂盒、小鼠黄嘌呤氧化酶试剂盒、小鼠髓过氧化物酶试剂盒、小鼠一氧化氮合酶试剂盒、小鼠一氧化氮试剂盒、小鼠微量还原型谷胱甘肽试剂盒均购自南京建成研究所；小鼠γ干扰素试剂盒、小鼠免疫球蛋白试剂盒、小鼠白细胞介素12试剂盒、小鼠白细胞介素2试剂盒均购自江苏晶美生物公司。

1.1.5 试验仪器

电子分析天平（METTLER TOLEDO，AB104-L，EL204瑞士）、超纯水机（Direct-Q，5UV型，密理博）、去离子水机（CD-UPT-1，成都纯越）、电热恒温水浴锅（HH-W21型，北京长源设备厂）、高速离心机（Eppendorf，Centrifuge 5418）、超低温冰箱（-80 ℃）（SANYO，MDF-U5386S）、超速低温离心机（SIGMA，3K15）、全自动切片机（德国，徕卡）、多功能酶标仪（瑞士）、紫外分光光度仪（型号：Uvmini1240，日本，岛津）、光学显微镜（奥林巴斯，日本株式会社）、微量离心机（Sigma，1-14型，美国）、电热恒温培养箱培养箱（天津泰斯特，WP25）、通风柜（型号：HDR-B07，科艺）、超净工作台（安泰空气技术有限公司，SWCJ-2F）、高压灭菌器（致微（厦门）仪器有限公司，GI36D）。

1.2 试验方法

1.2.1 动物试验

将SPF清洁级别60只昆明种小鼠随机分成6组，每组10只，雌、雄各半，分笼饲养，每笼5只。小鼠正常饲养3 d后进行正式试验。试验设空白对照组、阳性对照组、最低剂量组（CTX+25 mg/kg FNB）、低剂量组（CTX+50 mg/kg FNB）、中剂量组（CTX+100 mg/kg FNB）、高剂量组（CTX+150 mg/kg FNB），连续给药7 d。各组小鼠处理方式见表1。

1.2.2 测定指标及方法

1.2.2.1 临床表现

每天定时观察并记录小鼠的临床表现及活动情况，包括饮水、采食、精神状况、被毛状况、健康状况及日常活动。观察小鼠是否出现与药物相关的不良反应，记录小鼠不良反应出现的时间、程度、持续时间。

表1 各组小鼠处理方式Tab.1 Treatments of mice

1.2.2.2 血液生化指标及炎性因子水平

给药7 d后，最后一次给药后1 h，剖杀小鼠，对小鼠进行眼球采血，各组分别用1.5 mL EP管装取小鼠眼眶所采集的血液，所采的血液不加抗凝剂，血液样品于常温下倾斜静置2 h，取上层血清，严格按照试剂盒说明书分别测定白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素12（IL-12）、免疫球蛋白（IgG）、γ干扰素（IFN-γ）、溶菌酶（LZM）、黄嘌呤氧化酶（XOD）、髓过氧化物酶（MPO）、一氧化氮合酶试剂盒（NOS)、一氧化氮（NO）、微量还原型谷胱甘肽（GSH）的含量。

1.2.2.3 脏器指数

采血后所有试验小鼠颈椎脱臼处死，迅速解剖，采取脾脏和胸腺称重，以小鼠脏器质量（mg）/体重（g）计算脾脏、胸腺的脏器指数。将脾脏和胸腺浸泡在福尔马林固定液中固定7 d，制作组织切片，观察胸腺和脾脏的组织学是否发生变化。

1.2.3 病理组织学检查

给药7 d后采血处死的小鼠，取脾脏和胸腺分别制作病理组织切片。通过固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、修片与切片、展片与贴片、苏木素伊红（HE）染色、封片等步骤进行制作切片。观察组织切片的组织形态是否发生变化，并且将病理变化摄成图片。

1.3 数据统计与分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，单因素方差分析检验其组间差异显著性，用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 临床表现

试验期间，阳性对照组（即注射环磷酰胺的试验组）小鼠精神状态较差、食欲减退、被毛粗乱，有部分小鼠出现脱毛现象，个体较消瘦。空白对照组和添加不同剂量的FNB试验组饮食正常，精神状态良好，组间体重差异不明显。

2.2 FNB对免疫抑制小鼠脏器指数的影响（见表2）

表2 FNB对免疫抑制小鼠脏器指数的影响Tab.2 Effect of FNB on organ indices of immune suppressed mice (n=10) 单位 ：mg/g

由表2可知，与空白对照组比较，阳性对照组各种脏器指数极显著降低（P＜0.01），表明成功建立免疫抑制的小鼠模型；与阳性对照组比较，不同剂量的FNB试验组小鼠脾脏和胸腺指数有升高的变化。

2.3 FNB对免疫抑制小鼠细胞因子的影响（见表3）

由表3可知，与空白对照组比较，阳性对照组血清中IL-2、IL-12、IgG、INF-γ、LZM水平均明显降低，（P＜0.05），表明成功建立免疫抑制小鼠模型；与阳性对照组比较，不同剂量的FNB组中IL-12和IgG的水平显著升高（P＜0.05），其中在FNB中剂量组时LZM活性极显著升高（P＜0.01）。试验结果表明，一定浓度的FNB能够通过升高免疫抑制小鼠中的细胞因子水平而改善其免疫功能。

表3 FNB对免疫抑制小鼠细胞因子的影响Tab.3 Effect of FNB on cytokines in immunosuppressed mice（n=10） 单位 ：ng/L

2.4 FNB对免疫抑制小鼠生化指标的影响（见表4）

由表4可知，与空白对照组比较，阳性对照组血清中的XOD、MPO、NOS、NO、GSH活力均显著降低（P＜0.05）；各剂量FNB组中小鼠血清中的XOD、MPO、NOS、NO对比阳性组显著升高（P＜0.05），当FNB剂量达到150 mg/kg时，各指标水平均有下降的趋势。结果表明，一定浓度的FNB能提高免疫抑制小鼠血清中MPO、NOS、NO等生化指标的活力，有利于维持机体自由基的产生和清除平衡，降低免疫抑制带来的影响，从而改善其免疫功能。

表4 FNB对免疫抑制小鼠生化指标的影响Tab.4 The effect of FNB on the biochemical indexes of immunosuppressed mice（n=10） 单位 ：ng/L

2.5 小鼠脾脏和胸腺的病理组织学变化（见图1、图2）

由图1可知，空白对照组小鼠脾脏的脾小体结构完整、脾淋巴细胞密集、细胞轮廓清晰。环磷酰胺对照组小鼠脾脏脾小体数量显著减少、淋巴细胞稀疏、红髓区内有数量不等的嗜中性粒细胞浸润；不同浓度FNB组小鼠的脾小体尚可辨认，体积缩小，但淋巴细胞轮廓较清晰，局部见淋巴滤样增生。

由图2可知，空白对照组胸腺皮质和髓质结构清晰可辨，皮质区内淋巴细胞数量密集。环磷酰胺对照组和不同浓度FNB组小鼠胸腺皮质结构模糊，淋巴细胞数量减少，但环磷酰胺组胸腺组织内淋巴细胞明显稀疏，不同浓度FNB组小鼠胸腺内淋巴细胞数量较多，呈小结样增生。

3 讨论

本试验采用环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，试验观察FNB对小鼠免疫功能的调节作用。结果表明，小鼠经环磷酰胺处理后，临床表现个体消瘦、被毛粗乱、精神不佳；组织切片显示脾脏脾小体数量显著减少、胸腺皮质结构模糊；胸腺、脾脏指数低于空白对照组；同时环磷酰胺处理组小鼠血清中IL-2、IL-12、IgG、INF-γ的显著下降，表明免疫抑制小鼠模型建立成功。

免疫调节可维持机体生理平衡与相对稳定，在预防感染、免疫监视中发挥着重要的作用。脾脏是机体重要的外周免疫器官，是成熟淋巴细胞定居场所，胸腺是T细胞发育成熟的重要场所，与细胞免疫和体液免疫密切相关[6]。李振卿[7]对地衣多糖对免疫抑制小鼠免疫功能进行研究，结果表明，地衣多糖能够明显提高免疫抑制小鼠的脾脏指数、胸腺指数，显著提高免疫抑制小鼠的免疫功能。在本试验中，与环磷酰胺处理组比较，不同剂量的FNB组中IL-12、LZM、IgG的水平显著升高，其中IL-12可以有效激活NK 细胞，通过增强NK细胞的细胞毒性达到消除机体病原体和杀伤肿瘤细胞的目的，同时IL-12是T淋巴细胞的诱导因子，辅助T淋巴细胞增殖参与细胞免疫应答[8]。有研究表明，LZM通过破坏微生物细胞壁结构及抑制细胞膜内活性，从而致使机体内病原体裂解死亡[9]。此外，IgG也在自然被动免疫中起着至关重要的作用，IgG水平显著升高从侧面反映机体抵抗病原体的能力增强。因此，本试验结果说明一定浓度的FNB能够通过升高免疫抑制小鼠中的细胞因子水平而改善其免疫功能。

MPO可以使过氧化氢和氯离子反应生成次氯酸，次氯酸会氧化细胞成分，对病原微生物有杀灭作用，但当生成过量次氯酸，超过机体抗氧化防御能力时，反而会导致组织损伤[10]。胡小艳等[11]在金丝桃素对免疫抑制小鼠免疫功能和抗氧化能力的研究中发现，由环磷酰胺所致的免疫抑制小鼠MPO活性显著下降，但金丝桃素对MPO活性无显著影响。本研究中，免疫抑制小鼠血清中MPO活性也同样显著下降，但FNB处理后发现小鼠血清MPO活性增强，说明FNB可以调节MPO活性，降低机体免疫抑制带来的影响。NOS有3种亚型，分别是神经元型（nNOS）、诱导型（iNOS）、内皮型（eNOS），对机体内神经系统、血管、平滑肌等发挥着重要的调节功能，NO是在NOS的催化作用下产生[12]。NO作为一种自由基，具有病理与生理的双向调节作用，过量的NO会产生细胞毒性作用从而使机体正常细胞受损；体内适量的NO有利于维持机体稳态，发挥着免疫防御的作用[13-14]。因此，机体内的NOS活力和NO水平均需要维持在某种动态平衡状态。在本试验中，免疫抑制组小鼠的NOS活力和NO水平均显著降低，对其给予各剂量的FNB后发现小鼠NOS活力和NO水平显著升高。朱丹等[15]在金黄扶正茶对免疫抑制小鼠细胞免疫功能的研究中，免疫抑制组小鼠腹腔巨噬细胞NOS活力显著降低，药物组显著上升。在对水产动物的研究中也呈现出相似结果。李义等[16]对竹笋多糖对免疫抑制中华绒螯蟹的免疫调节研究中发现，免疫抑制组中华绒螯蟹血清中NOS活性显著下降，给予竹笋多糖后NOS活性上调，这与本试验结果相一致。提示FNB可以使免疫抑制小鼠血清中失调的NOS、NO靠近正常水平，促使其恢复正常生理活性，从而提高免疫功能，但其中的具体调控机制还需要进一步研究。

徐璐等[17]对黄芪总黄酮对小鼠免疫功能进行研究，结果表明，黄芪总黄酮能显著增强小鼠的免疫功能。刘爱华等[18]对木瓜总黄酮抗肿瘤活性进行研究，结果表明，木瓜总黄酮可以促进机体对肿瘤的免疫应答，最终达到抑制肿瘤生长，提高肿瘤鼠存活率的作用。皮建辉等[19]对金银花黄酮对小鼠免疫调节作用进行研究，结果表明，金银花黄酮能显著提高免疫抑制小鼠的脏器指数，金银花黄酮能显著调节小鼠血清免疫酶活性，提高淋巴器官的抗氧化功能，表明其具有良好的免疫调节功能。本研究结果表明，辣寥黄酮对环磷酰胺引起的小鼠免疫功能抑制有拮抗作用，可以增强小鼠的免疫功能。

4 结论

辣寥黄酮不仅可以通过升高机体细胞因子水平来对抗环磷酰胺引起的小鼠免疫功能抑制，还可以通过调节NO水平和MPO、NOS等活性来降低免疫抑制带来的影响，从而增强小鼠免疫功能。