CRISPR/Cas9基因敲除研究进展

白祥慧

（青海师范大学生命科学学院，青海 西宁 810008）

探索基因在信号通路中的作用是生命科学研究领域的热点问题之一[1]。基因敲除技术是一种可以验证基因功能的新型技术手段[2]，是验证基因功能的常用标准[3-4]。CRISPR/Cas9系统作为一种新型基因编辑技术，可以精确、高效地对基因组进行敲除或修饰，可在较短时间内获得基因敲除突变体，从而更好地完成基因功能的研究[5]。CRISPR/Cas9技术极大地扩展现有模式生物基因操作的可能性，已成为构建新动物模型必不可少的工具。因此，基因组编辑对重要农业物种的发展具有积极作用，如山羊、绵羊、猪和奶牛的育种。使用CRISPR/Cas9系统可编辑具有复杂基因组结构的新模式生物[6]。文章综述近年来CRISPR/Cas9的应用进展。

1 CRISPR/Cas9基因敲除作用机理

CRISPR/Cas9系统由一个单体蛋白和一个嵌合RNA组成。序列特异性由gRNA中的20NT序列赋予，裂解由Cas9蛋白介导[7]。CRISPR/Cas9是一种编辑效率较高的新型基因靶向修饰技术，该技术可通过一段sgRNA来识别靶位点，利用Cas9蛋白进行切割，产生双链DNA断裂。真核生物可以通过非同源末端连接修复方式和同源重组方式进行自我修复，从而达到高效的基因编辑效果。CRISPR/Cas9胚胎显微注射移植法引导Cas9裂解酶裂解相应基因，从而删除外显子核苷酸，构建基因敲除模型。

2 CRISPR/Cas9基因敲除技术的应用

2.1 动物模型的构建

基因敲除动物是指利用基因敲除技术和胚胎干细胞技术制备的某一特定位点基因缺失的动物[8]。随着技术不断更新，CRISPR/Cas9基因敲除技术日趋成熟，为动物领域研究提供便利。

马友才等[9]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PDE5基因敲除模型并进行表型鉴定，研究PDE5基因在相关疾病中的生理机制，为一些疾病的治疗及靶向药物的开发利用提供新思路。黄思嘉等[10]利用CRISPR/Cas9基因编辑系统精确编辑鸡AMHR2基因。鲁国涛[11]利用CRISPR/Cpf1系统编辑鸡DF-1细胞，为揭示DDX21基因的功能及致病机理奠定基础。CRISPR/Cas9基因编辑技术在人类细胞中同样适用，镰刀型细胞贫血症也称为地中海贫血症，有研究者利用Cas9编辑技术修饰sgRNA-RNP，进而编辑造血干/祖细胞（HSPCs）中的HBG1/2启动子，实现对β-地中海贫血患者源性热休克细胞编辑[12]。

利用CRISPR/Cas9系统构建动物模型是较常见的操作方法。Ding等[13]利用CRISPR/Cas9系统，运用显微注射法将CassnRNA和sgRNAs注射到单细胞期胚胎中，成功地实现绵羊MSTN基因的精确基因编辑，结果显示，MSTN基因敲除绵羊可以作为理想动物模型。庞米米等[14]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR9基因敲除鼠动物模型，研究表明，通过该技术成功构建TLR9基因敲除动物模型，为研究TLR9基因功能和分子机制提供理想模型。张世阳等[15]通过CRISPR/Cas9系统成功地获得Spag6基因编辑的突变体，为进一步探讨斑马鱼Spag6基因的体内功能奠定基础。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在人类疾病研究中被广泛使用。Shalem等[16]使用慢病毒转染人细胞构建CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文库，筛选出目标基因，进行基因编辑，最终证明Cas9具有广阔的应用前景。Platt等[17]为使Cas9在体内得到广泛的应用，建立一个Cre依赖的Cas9敲除小鼠，用于癌症动物模型。

2.2 细胞系的构建

伴随分子细胞水平研究的深入，许多难以传代的细胞严重影响试验进度，影响后续试验的顺利开展。因此，构建细胞系迫在眉睫。构建细胞系的方法有多种，而CRISPR/Cas9是其中之一。孙谨等[18]利用CRISPR/Cas9基因敲除系统，构建IL-12p35基因C6细胞系，为胶质肿瘤细胞的发生提供理论依据。有研究表明，利用该技术手段介导猪相关细胞，成功构建细胞系[19]。张红等[20]利用CRISPR/Cas9技术成功构建FSTL1基因敲除的SiHa细胞稳定株。李浩可等[21]利用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除Lrtm1基因的C2C12细胞系，为研究Lrtm1基因的作用提供试验基础。这些细胞系的构建为试验研究提供基础资料。

2.3 微生物的构建

CRISPR/Cas9为细菌和古细菌抗噬菌和质粒提供分子免疫。蒋成辉等[22]利用CRISPR/Cas9基因敲除技术成功构建耐甲氧西林金黄色葡萄球USA300菌株，阐明金黄色葡萄球菌的作用机理。杨行堂等[23]运用基因敲除技术建立幽门螺旋杆菌感染的C57BL基因小鼠模型，为相关研究提供理论依据。CRISPR/Cas是一种微生物适应性免疫系统，使用RNA引导的核酸酶切割外来遗传元素[24-26]。3种类型的CRISPR系统（I-III）已经在广泛的细菌和古细菌宿主中被鉴定出来，其中每个系统包括一组CRISPR相关（Cas）基因、非编码RNA和一系列独特的重复元素（直接重复）。这些重复序列由短的可变序列组成[27]，来自称为原间隔区的外源DNA靶点，一起构成CRISPR RNA（crRNA）阵列。在DNA靶区内，每个原间隔区总是与一个原间隔区相邻基序（PAM）相关联，而PAM的变化取决于特定的CRISPR系统[28-30]。

3 展望

通过基因敲除技术逐渐明确大量模式生物和重要功能微生物的全基因组，并能准确定位功能基因，从基因水平上更加清楚地认识微生物的代谢规律。同时，敲除载体及相关技术的完善可进一步推动微生物代谢工程的广泛应用，通过基因敲除手段改变微生物细胞的代谢流向，阻断有害代谢产物积累，有望降低成本，大幅度提高生产水平及产品纯度。

近年来，由于抗生素滥用，多种常见病均出现耐药性，因此可以尝试从功能基因角度研究耐药基因，利用CRISPR/Cas9基因敲除技术，敲除相应基因，进而探讨耐药机制，并开发研制抑制耐药性、增强抗菌的药物，也可研制具有预防和治疗作用的功能性食品。利用基因敲除技术敲除调控肿瘤的相关基因，或抑制肿瘤的生长或促进肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。基因敲除技术可以研究基因结构和功能，可应用于调控细胞周期、疫苗的研发与制备等领域。由此可见，基因敲除技术具有广阔的发展前景。