不同种类的ZnO 纳米颗粒对人胃黏膜上皮细胞离子吸收的影响

王咪咪 吴明红 王艳丽

(1.上海大学环境与化学工程学院， 上海 200444; 2.上海大学纳米化学与生物学研究所， 上海 200444;3.上海大学肿瘤精准靶向研究中心， 上海 200444)

ZnO 纳米颗粒(nanoparticles， NPs)因其独特的形态结构以及合成便利性， 使得市场上有许多基于ZnO NPs 的产品[1-3].例如， 生活中最常用的防晒霜和日常护理品[2]、食品添加剂、食品包装和软膏等[3].已有的关于ZnO NPs 对细胞以及生物毒性影响的研究结果表明， ZnO NPs 可直接损害肺系统， 随后诱发弥漫性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征， 严重的甚至会致人死亡[4-6].Wang等[7]研究发现， 维生素C 可使ZnO NPs 的细胞毒性加强.Go等[8]也研究了含有ZnO NPs 的复合体系对生物体的影响.

Fe3+， Ca2+和Mg2+作为维持动物细胞活力的重要阳离子， 是许多酶促反应必不可少的辅助因子.它们能够通过细胞膜上的离子通道进入细胞， 影响细胞的生命活动[9-12].人体内缺铁会造成缺铁性贫血， 严重时会出现心脏扩大， 甚至心力衰竭等症状.钙元素含量过低会导致骨质疏松、软骨病等疾病.镁元素含量过高会产生高镁血症， 导致肾衰竭和甲状腺功能减退等疾病.本工作以人胃黏膜上皮细胞(gastric epithelium cells-1， GES-1)为研究对象， 将5 种不同的ZnO NPs 设置不同的实验浓度， 并与GES-1 共同培养， 通过电感耦合等离子体发射光谱仪(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometer， ICP-AES)测定细胞内Fe3+，Ca2+和Mg2+的浓度， 以此来研究不同种类ZnO NPs 对离子吸收的影响.后续通过对细胞活性以及活性氧(reactive oxygen species， ROS)水平的检测， 探究了ZnO NPs 影响离子吸收的机理.

1 实验材料和方法

1.1 实验材料与仪器

GES-1 细胞(上海美轩生物公司)， DMEM 培养基(上海赛戈生物科技有限公司)， 北美特级胎牛血清(上海熠晨生物科技有限公司)， 25% Typsin-EDTA(美国Invitrogen 公司)， ZnO NPs(杭州万景新材料有限公司、南京海泰纳米材料公司)， 六水合三氯化铁(中国国药集团化学试剂有限公司)， Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(日本同仁化学研究所)， 活性氧水平检测试剂盒和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH)细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所).

微量移液枪(0.5～20 μL， 20～200 μL， 100～1 000 μL， 德国Eppendorf 公司)， XDS-1B 倒置显微镜(重庆光电仪器有限公司)， YJ-875 型医用净化工作台(苏州净化有限公司)， Allegra X-15R 离心机(美国Beckman 公司)， MLS-3750 高压灭菌锅(日本三洋公司)，-80°C 超低温冰箱(美国Thermo 公司).

1.2 实验步骤

1.2.1 5 种ZnO NPs 的表征

本工作使用透射电子显微镜(transmission electron microscope， TEM)观察ZnO NPs 的形貌， 同时使用动态光散射仪(dynamic light scattering， DLS)和纳米粒度及电位分析仪(ZataSizer 3000HSA)分析了ZnO NPs 样品在液体中的粒径和表面电势.

1.2.2 细胞培养与传代

取生长良好的GES-1， 将其培养在含有10%胎牛血清的DMEM 培养基中.当细胞密度达到70%～80%时， 用移液枪将上清吸出.加入2 mL 胰酶消化3 min 后， 再加入新培养基终止消化.转移至15 mL 离心管中， 1 200 r/min 离心3 min.去除上清， 加入适量的新培养基重悬细胞.吸取一定量转移至已加入新培养基的培养瓶内， 于恒温培养箱中继续培养.

1.2.3 ICP-AES 测定Fe3+， Ca2+， Mg2+和Zn2+的浓度

取生长良好的GES-1 接种于6 孔板中， 待GES-1 铺满60%～70%时， 吸出培养基.重新加入2 mL 由不同种类的ZnO NPs(50 nm ZnO NPs(亲水)， 50 nm ZnO NPs(亲油)，100 nm ZnO NPs(亲水)， 20 nm ZnO NPs(亲水)， 20 nm ZnO NPs(亲油))配成的不同质量浓度(5， 10， 15 mg/L)的培养基， 同时每孔都含20 μmol/L Fe3+.每个样本设置3 个平行样.设置只用培养基(不含ZnO NPs，仅含20 μmol/L Fe3+)培养的细胞作为对照组，同样设置3 个平行样.恒温培养箱继续培养24 h 后， 收集样品， 并将收集到的细胞计数.转移到20 mL 的玻璃管中， 用王水进行消解， 赶酸后用ICP-AES 测定溶液中Fe3+， Ca2+， Mg2+和Zn2+的浓度.

1.2.4 CCK-8 试剂盒检测细胞活力

取生长良好的GES-1 接种于96 孔板中， 待GES-1 铺满60%～70%时， 吸出培养基.重新加入100 μL 由不同种类的ZnO NPs 配成的不同质量浓度(10， 15， 18， 20， 25， 30 mg/L)的培养基作为实验组.设置只用培养基培养的细胞作为对照组， 继续于恒温培养箱中培养24 h.加入含有10 %CCK-8 试剂盒试剂的新培养基， 继续培养1～2 h， 然后用酶标仪在450 nm 处测定吸光度.

1.2.5 LDH 法检测细胞膜的完整性

取生长良好的GES-1 接种于96 孔板中， 待GES-1 铺满60%～70%时， 吸出培养基.重新加入100 μL 含1%胎牛血清的， 且由不同种类的ZnO NPs 配成的不同质量浓度(5， 10，15 mg/L)的培养基作为实验组.设置只用培养基培养的细胞作为对照组，每个样本设置6 个平行样，继续在恒温培养箱中培养24 h.细胞最大酶活性对照组为加入10 μL LDH 释放试剂培养1 h 的细胞.根据试剂盒的操作步骤处理样本， 然后用酶标仪在490 nm 处测定吸光度.

1.2.6 细胞内ROS 水平的测定

取生长良好的GES-1 接种于96 孔板中， 待GES-1 铺满60%～70%时， 吸出培养基.重新加入由不同种类的ZnO NPs 配成的不同质量浓度(5， 10， 15 mg/L)的培养基作为实验组.设置只用培养基培养的细胞作为对照组.培养时间结束后， 按照ROS 水平检测试剂盒的操作步骤进行样本处理， 使用酶标仪在525 nm 处测定吸光度.实验组与对照组测得的数据比值就是细胞内ROS 水平的变化.实验重复3 次， 每次设置3 个平行样.

2 结果和讨论

2.1 ZnO NPs 的表征

图1 为不同种类的ZnO NPs 的TEM 照片.可以看到， ZnO NPs 呈现出的形态大小不均，大部分是不规则的球状或棒状形态.王宁等[13]的研究发现， ZnO NPs 一旦进入水环境， 会因为颗粒间的相互作用而发生团聚.从表1 也可以看出: 不论是在水中还是在培养基中， ZnO NPs 都容易发生团聚; 与培养基相比， ZnO NPs 在水中的分散性更好; ZnO NPs 在培养基中的表面电势约为-5 mV， 再次证明了ZnO NPs 在培养基中是不能稳定存在的.

表1 ZnO NPs 在水中和在培养基中的水合粒径以及表面电位Table 1 Hydrodynamic diameters and zata potential of ZnO NPs in culture medium and in water

图1 5 种类型ZnO NPs 的TEM 图片Fig.1 TEM images of the five types of ZnO NPs

2.2 ZnO NPs 及其复合体系对GES-1 活力的影响

采用CCK-8 试剂盒测定了不同种类的ZnO NPs 以及15 mg/L 100 nm ZnO NPs(亲水)与不同浓度Fe3+组成的复合体系对GES-1 活力的影响， 结果如图2 所示， 其中**P和*P表示与对照组相比的显著性差异， **P ＜0.01， *P ＜0.05.

Reshma等[14]在探究不同质量浓度的ZnO NPs 对人胚肾细胞的毒性影响时发现， 当ZnO NPs 的质量浓度低于50 mg/L 时， 人胚肾细胞存活率约为80%.由图2(a)～(e)可以看出:当50 和100 nm ZnO NPs 的 质 量 浓 度 为18 mg/L 时， GES-1 的 细 胞 活 力 显 著 下 降; 当20 nm ZnO NPs 的质量浓度为18 mg/L 时， GES-1 的细胞活力为正常细胞的50%左右; 当5 种类型的ZnO NPs 的质量浓度为15 mg/L 时， GES-1 的细胞活力都表现得比较正常.

人体血液中的Fe3+浓度为10～30 μmol/L， 本工作选取15 mg/L 100 nm ZnO NPs(亲水)与不同浓度Fe3+组成复合体系， 探究了Fe3+的实验浓度.由图2(e)可知， 当Fe3+浓度为10 和20 μmol/L 时， GES-1 的细胞活力均表现正常.为了防止Fe3+浓度过低， 样本处理过程中误差变大， 所以本工作选取20 μmol/L 作为Fe3+的实验浓度.

图2 不同培养基对GES-1 活力的影响Fig.2 Viability of GES-1 after exposed to different culture medium

2.3 ZnO NPs 对细胞吸收Fe3+， Ca2+和Mg2+的影响

采用原子吸收光谱法检测了不同种类的ZnO NPs 对细胞吸收Fe3+， Ca2+和Mg2+的影响， 结果如图3 和4 所示， 其中**P和*P表示与对照组相比的显著性差异， **P ＜0.01，*P ＜0.05.

Sembratowicz等[15]发现在体外培养时， 金纳米颗粒会抑制Fe3+， Ca2+和K2+的吸收.Hara等[16]发现， 二果糖酐Ⅲ会促进大鼠大肠中铁的吸收.由图3 可以看出: ZnO NPs 会增加细胞对Fe3+， Ca2+和Mg2+的吸收; 不同粒径的ZnO NPs 对GES-1 离子吸收的影响不同， 其中50 nm ZnO NPs(亲水)对离子吸收的影响最为显著.加入50 nm ZnO NPs(亲水)会使细胞对Fe3+和Mg2+的吸收更为敏感.当培养基中含有5 mg/L 50 nm ZnO NPs(亲水)时， 细胞对Fe3+和Mg2+的吸收相较对照组分别增加了28.4%和23.1%.随着ZnO NPs 质量浓度的升高， Fe3+， Ca2+和Mg2+在细胞内的浓度逐渐增加， 当ZnO NPs 的质量浓度为15 mg/L 时，细胞离子吸收的浓度最高.当用15 mg/L 50 nm ZnO NPs(亲水)处理细胞时， 细胞对Fe3+，Ca2+和Mg2+的吸收相较对照组分别增加了271.8%， 173.7%和137.5%.由图4 可以看出，ZnO NPs 的亲水和亲油特性对细胞离子吸收没有显著影响.

图3 不同粒径ZnO NPs 对离子吸收的影响Fig.3 Effects of ion absorption at different particle sizes of ZnO NPs

图4 具有不同表面特性的ZnO NPs 对离子吸收的影响Fig.4 Effects of ion absorption at different surface properties of ZnO NPs

2.4 ZnO NPs 对细胞毒性的影响

Mortimer等[17]研究发现， ZnO NPs 对细胞的毒性与其溶解出的Zn2+有关.本工作探究了GES-1 内Fe3+， Ca2+和Mg2+的浓度变化与Zn2+浓度之间的关系， 结果如图5 所示， 其中*P表示与对照组相比的显著性差异， *P ＜0.05.

由图5(a)可知: 相对于另外3 种纳米颗粒， 经50 nm ZnO NPs(亲水)培养后， GES-1 内的Zn2+浓度最高， 特别是10 和15 mg/L 50 nm ZnO NPs(亲水)，Zn2+浓度相较于对照组分别增加了97.5%和283.9%.由此可以看出， GES-1 内Zn2+浓度的升高， 在一定程度上会影响细胞内Fe3+， Ca2+和Mg2+的浓度.由图5(c)可以看出， 在体外实验仅含有ZnO NPs 的培养基中， 50 nm ZnO NPs(亲水)在15 mg/L 质量浓度时溶出的Zn2+浓度最高.

图5 在不同环境中的实验组与对照组Zn2+含量对比Fig.5 Comparisons of Zn2+ content in experimental groups and control group in different environment

2.5 ZnO NPs 影响Fe3+， Ca2+和Mg2+吸收的机理探讨

由于离子通道或特定转运蛋白质的存在， 矿物质可以通过简单的扩散或主动运输进入细胞.Espinoza等[18]通过抑制二价金属转运蛋白和人体内铜转运蛋白， 观察到人结直肠腺癌细胞对Fe， Gu 和Zn 的摄取减少.Salovaara等[19]研究了不同种类的有机酸对上皮细胞系中铁离子吸收的影响， 观察到酒石酸、苹果酸、琥珀酸和富马酸可以增强铁离子的吸收， 并显示离子吸收模式与有机酸的化学结构有关.本工作分别对经ZnO NPs 处理过的GES-1 的细胞活力、细胞膜损伤程度和细胞内的氧化还原水平进行了检测， 来探究ZnO NPs 影响GES-1 内Fe3+，Ca2+和Mg2+吸收的过程， 结果如图6 所示， 其中**P和*P表示与对照组相比的显著性差异，**P ＜0.01， *P ＜0.05.

由图6(a)可以看出: 15 mg/L 50 nm ZnO NPs 会对细胞产生毒性， 相较对照组活力降低了62.7%; 另外3 种ZnO NPs 在此质量浓度对细胞活力没有显著影响.由图6(b)可以看出:当质量浓度为15 mg/L 时， ZnO NPs 会导致细胞膜不同程度的损伤.由图6(c)可以看出:当质量浓度为10 mg/L 时， ZnO NPs 会影响细胞内的ROS 水平; 当质量浓度为15 mg/L 时，GES-1 内ROS 水平明显升高， 其中经20 nm(亲水)， 20 nm(亲油)， 50 nm 和100 nm 处理过的细胞分别升高了25.45%， 29.75%， 99.4%， 41.8%.根据图6 的结果可知: 在低质量浓度时， ZnO NPs 对GES-1 没有明显毒性， 但会导致细胞内的氧化还原水平升高， 甚至造成细胞膜的轻微损伤， 从而影响细胞对Fe3+， Ca2+和Mg2+的吸收.

图6 不同质量浓度的ZnO NPs 培养24 h 对GES-1 的影响Fig.6 Effects of different concentrations of ZnO NPs on GES-1 cultured for 24 h

3 结束语

本工作将不同种类的ZnO NPs 与GES-1 共同培养24 h， 观察细胞吸收Fe3+， Ca2+和Mg2+的浓度变化， 为纳米颗粒对细胞离子吸收的影响提供理论依据.研究结果表明: 当ZnO NPs 的质量浓度较低时， 会导致GES-1 内Fe3+， Ca2+和Mg2+浓度升高; 细胞内离子吸收与ZnO NPs 的粒径和质量浓度有关， 50 nm ZnO NPs 在质量浓度为15 mg/L 时对离子吸收的影响最为明显， 细胞内Zn2+质量浓度的增加是导致离子吸收稳态失衡的原因之一; 当ZnO NPs 的质量浓度较低时， 细胞活力虽然正常， 但细胞内的ROS 水平会上升且细胞膜出现损伤，所以也会导致细胞内离子浓度的升高.