电针心包经穴对MCAO 大鼠血清和脑组织突触素及突触后致密物-95 表达的影响

谢峥嵘 ，肖豆，唐雅妮，柯超，石文英，潘江，章薇，陈成

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

脑梗死是由于不同原因导致动脉狭窄或完全堵塞，使脑组织缺血、缺氧、坏死，引起神经功能障碍的一种脑血管疾病。通过调控机体相关突触可塑性物质的表达可促进神经功能的修复[1]。突触素（synaptophysin，SYP）作为一种特异性标志性囊泡蛋白[2]，与突触的结构和功能有着密切的关系，可直接反映突触的数量和密度分布，突触后致密物-95（postynaptic density，PSD-95）是突触后膜上最主要的神经细胞骨架蛋白，参与突触的连接与形成，维持突触的可塑性[3-4]。SYP、PSD-95 不仅是是突触前后的重要标志物，也是突触可塑性标志物[5]。本研究采用局灶性脑缺血模型（MCAO），观察电针心包经穴对模型大鼠血清及脑组织SYP 和PSD-95 表达的影响，探讨针刺对脑缺血后突触可塑性的作用机制，为临床应用心包经穴治疗脑缺血提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级健康成年雄性SD 大鼠90 只，3～4 月龄，体质量220～250 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。实验前所有动物均在安静环境下饲养，室温22 ℃，相对湿度55%～70%，其饲养笼具、垫料、饲料、饮水均按照SPF 级实验动物要求进行制备和消毒，造模前禁食24 h。实验过程中对动物的处置遵循中华人民共和国科学技术部2006 年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》及伦理学规定。

1.2 主要试剂与仪器

SYP 联酶试剂盒（CSB-E13827r），武汉华美生物工程有限公司；PSD-95 联酶试剂盒（ml028404），上海联酶生物科技有限公司；miRNA 反转录试剂盒（CW2569），北京康为世纪生物科技有限公司；DM2000Plus DNA Marker（CW0632），北京康为世纪生物科技有限公司。SDZ-Ⅱ华佗电针治疗仪、华佗牌0.30 mm×15 mm 一次性针灸针（苏州医疗用品厂有限公司），台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，H1650R），全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司，PW-812），多功能酶标分析仪（深圳市汇松科技发展有限公司，MB-530），荧光定量RCP 仪（美国Thermo 公司，PIKOREAL96），荧光PCR 板（美国Thermo 公司，SPL0960），电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-2C）。

1.3 分组、造模及干预

参照Longa[6]和Koizumi[7]方法制备MCAO 大鼠模型，即颈外动脉插入线栓法建立MCAO 左侧脑缺血模型。大鼠造模完成后采用Zea Longa 5 级4 分制评分：无神经功能缺损计0 分；梗死对侧前爪内收、伸直障碍计1 分；向偏瘫侧转圈者计2 分；行走时向偏瘫侧倾倒计3 分；意识丧失、不能行走计4 分。选取评分为1～3 分大鼠纳入观察。动物分组采用先造模后分组方式，将90 只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、心包经组、肺经组，每组再分为14、21、28 d 3 个时间点，每个时间点6 只。正常组正常喂养，予以捆绑处理；假手术组分离出血管后不插线，捆绑处理；模型组捆绑处理；心包经组电针心包经穴；肺经电针肺经穴。

1.4 针刺方法

根据《实验针灸学》[8]动物穴位图谱及拟人比照法定位：按经脉“从胸走手”的循行方向，依次选取右侧瘫痪肢体不同节段的常用穴位作为心包经、肺经的代表穴，手厥阴心包经选取“大陵”“内关”“曲泽”“天泉”，手太阴肺经选取“太渊”“列缺”“尺泽”“天府”。

正常组、假手术组、模型组捆绑30 min 处理，不行电针剌激。心包经组、肺经组成模后第2 日开始每日电针治疗，每次30 min，连续电针6 d，间隔1 d，继续电针，分别至14、21、28 d 取材。大鼠捆绑后用0.3 mm×15 mm 毫针刺入大鼠右侧穴位，手厥阴心包经“天泉”“曲泽”一组、“内关”“大陵”一组，手太阴肺经“天府”“尺泽”一组、“列缺”“太渊”一组。以上穴位接SDZ-Ⅱ华佗电针治疗仪，极性固定，近心端接正极，远心端接负极。电针刺激参数：连续波，输出电压2～4 V，输出电流4～6 mA，强度以局部组织轻颤为度。

1.5 检测指标

1.5.1 血清突触素和突触后致密物-95 含量检测

治疗结束后，大鼠10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，静置2 h，3000 r/min 离心15 min，严格按照试剂盒说明书操作，ELISA 检测大鼠血清SYP和PSD-95 含量。以标准品浓度为纵坐标，OD 值为横坐标，使用Curve Expert 软件进行分析，并根据提示制作标准曲线。根据标准品的浓度与OD 值计算回归方程，将样本OD 值代入方程式，计算样本浓度再乘以相应的稀释倍数，即为样本的实际浓度。

1.5.2 脑组织突触素和突触后致密物-95 mRNA 表达检测

治疗结束后，处死大鼠，断头取脑，切取病灶侧脑组织，RT-qPCR 检测脑组织SYP、PSD-95 mRNA表达，提取RNA 标本次日备用，121 ℃、60 min 湿热灭菌，烘干。取保存在Trizol 中组织约0.02 g，加入1 mL Trizol 于匀浆器中充分研磨匀浆，混匀后室温裂解5 min；取上层液，转移至新的RNase-Free 离心管中；加入等体积异丙醇，混匀，室温静置10 min；4 ℃、12 000 r/min 离心3 min，弃上清液；干燥5～10 min。加入20～30 μL 无菌无酶水溶解沉淀；紫外分光光度计测定浓度，吸取2 μL RNA 溶液于石英比色杯，用无酶水定容至100 μL，于260 nm 与280 nm波长处测其吸光度，计算其浓度和纯度，比值在1.8～2.0。运用Primer5 软件设计引物，引物由上海生工合成。实时定量PCR 引物序列见表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 电针心包经穴对模型大鼠血清突触素和突触后致密物-95 含量的影响

与正常组、假手术组比较，模型组大鼠血清21、28 d SYP 和PSD-95 含量均明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，心包经组大鼠血清21 d SYP 含量明显升高，28 d PSD-95 含量明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与同一时间点肺经组比较，心包经组大鼠血清各时间点SYP 和PSD-95 含量均升高，除28 d SYP外差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清SYP、PSD-95 含量比较（，ng/mL）

表2 各组大鼠血清SYP、PSD-95 含量比较（，ng/mL）

注：与正常组、假手术组比较，★P＜0.05，★★P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肺经组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01

2.2 电针心包经穴对模型大鼠脑组织突触素和突触后致密物-95 mRNA 表达的影响

与正常组、假手术组比较，模型组大鼠脑组织SYP、PSD-95 mRNA 表达明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，心包经组大鼠脑组织SYP、PSD-95 mRNA表达明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与同一时间点肺经组比较，心包经组大鼠脑组织SYP、PSD-95 mRNA表达明显升高（P＜0.01）。结果见表3。

表3 各组大鼠脑组织SYP、PSD-95 mRNA 表达比较（）

表3 各组大鼠脑组织SYP、PSD-95 mRNA 表达比较（）

注：与正常组、假手术组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肺经组比较，●●P＜0.01

3 讨论

目前，针灸作为一种干预脑卒中发生及改善其肢体功能障碍、言语困难等症状的有效手段被临床广泛运用，其治疗机制的研究也日益深入。许多研究表明，针刺“足三里”“百会”等可通过抑制炎症因子、保护神经细胞、促进神经生长因子等作用对抗脑缺血损伤[9-11]，但多为督脉或阳明经穴，而运用心包经穴与他经对比研究鲜有报道。手厥阴心包经虽未直接联系脑，而其“主脉所生病”可直接调控心主血脉功能，间接起到影响脑血管功能的作用，即心包经-心主血脉-疏通脑络（靶器官效应），而肺具有朝百脉、主治节的功能，通过肺气的运动辅心行血，调节全身血流，可对脑血管功能产生影响，故而选用心包经与肺经对比。本研究团队前期从抗缺血后细胞凋亡及炎性物质的角度开展针刺心包经与脑关系的研究，发现针刺手厥阴心包经穴对MCAO 大鼠具有不同程度的治疗效应。针刺“内关”等可稳定心电活动、抑制心肌酶、调控血清白细胞介素-1β（IL-1β）的水平，并可抑制脑细胞凋亡蛋白Bax、IL-1β 及转化酶Caspase-1 mRNA 在脑组织的表达；电针心包经穴能促进脑组织神经生长因子表达，起到促进缺血半暗带血管新生、修复神经的作用[12-15]。形成从脑病及心→从心治脑→针刺效应→物质变化→脏腑效应等多层次、多角度初步探讨心脑相关的规律及联系途径。

SYP 作为一种特殊的突触囊泡蛋白，是突触可塑性的特异性分子标志物[16]，可通过影响突触结构和神经递质释放调节突触可塑性，SYP 参与Ca2+依赖神经递质释放和囊泡运输，其表达水平间接反映突触结构的完整性和功能状态。SYP 的增加表明突触数量、突触传递功能和突触可塑性的增加[17]。在中枢神经系统损伤中，SYP 的表达都伴有不同程度变化，PSD 是突触后信号整合的关键物质，对突触效能传递影响十分重要[18]。采用双侧颈总动脉闭塞术制备的慢性脑低灌注大鼠模型中发现大鼠海马区SYP 表达含量下降，且伴有不同程度的行为学改变[19]。PSD-95 作为突触后致密物中含量最丰富的结构蛋白，同时也是一种锚定蛋白，其本身无蛋白酶的活性，主要通过其自身不同的结构域与N-甲基-D-天冬氨酸受体、钾离子通道、细胞黏附因子、细胞质蛋白互相结合，形成相关的信号复合物，参与突触的生长与连接，维持和调控神经元突触的可塑性[20-21]。在永久性局灶性MCAO 脑缺血模型大鼠中发现，皮质层和海马区PSD-95 含量明显减少，并且其表达与脑缺血损伤的程度密切相关[22]。

本研究采取针刺手厥阴心包经穴为外源性干预手段，观察不同时间点梗死大鼠血清及脑组织SYP和PSD-95 的表达。本实验结果表明，针刺心包经穴、肺经穴可提高21 d 血清SYP 和21、28 d 血清PSD-95的含量，且具有经脉特异性，心包经组优于肺经组，但就两者总体的表达趋势而言，存在时间点表达上的不稳定性，考虑脑梗死病变部位在脑，并且SYP 和PSD-95 作为中枢神经系统突触前、突触后的特殊分子标志物，可能其作用的最终靶点应在脑组织，并非是血清。而针对脑组织SYP、PSD-95 mRNA 的表达，本实验结果显示，电针心包经穴能明显提高不同时间点脑组织SYP、PSD-95 mRNA 的表达，且心包经作用优于肺经组，这可能与部分学者认为在脑缺血损伤后PSD-95 的含量在14 d 后明显增加或可能处于脑梗死恢复期，已经发生了突触的重塑有一定关联[23-24]。本实验肺经组对部分时间点血清SYP 和PSD-95 的含量及21 d 梗死区SYP mRNA 的表达产生作用，可能与朝百脉、主治节，调节全身血流的作用有关，但目前缺乏其他研究对照，考虑与样本量小有关。

综上，电针心包经穴可提高梗死大鼠血清SYP和PSD-95含量及脑组织SYP、PSD-95 mRNA的表达，调节脑缺血后突触的可塑性，为临床上运用心包经穴治疗脑缺血提供了一定的实验依据。