生脉饮“异病同治”糖尿病和心力衰竭的网络药理学作用机制研究

王旭杰，张菀桐，王妙然，李秋艳，指导：翁维良

中国中医科学院西苑医院，北京 100091

生脉饮由人参、麦冬、五味子组成，出自金元时期张元素《医学启源》，主治温、暑热邪所致耗气伤阴或久咳伤肺，津液外泄等气阴两虚证。方中人参甘温，为君药，归脾、肺、心、肾经，大补元气、生津养血、益智安神；麦冬甘寒，为臣药，归心、肺、胃经，滋阴生津、清心润肺；五味子酸温，为佐药，归肺、心、肾经，益气生津、收敛固涩、宁心补肾。三药合用，一补一润一敛，共奏补益气阴、生津止渴、敛阴止汗之功[4]。《医方集解》云：“人有将死脉绝者，服此能复生之，其功甚大。”目前，生脉饮在传统散剂、汤剂的基础上采用现代技术开发出注射液、口服液等新剂型，主治范围十分广泛，临床常用于治疗慢性支气管炎、肺结核、冠心病、心力衰竭、心律失常、糖尿病等[5]。实验研究表明，生脉饮加减及其各类制剂可能通过抗氧化自由基产生，阻断高血糖和糖化终末产物，从而抑制系膜细胞增殖、非酶糖化反应及胰岛细胞凋亡与坏死等机制起到降低血糖的作用[6-8]，并且通过抑制心肌细胞凋亡、扩张冠状动脉、提高心肌缺氧耐受性、减慢心室重构、增强心脏泵血功能、降低肾素活性及增加心力衰竭患者内源性洋地黄物质血清水平等机制改善心功能，抗心肌缺血缺氧，从而达到防治心力衰竭的目的[9-12]。本研究采用网络药理学方法，从“异病同治”角度系统探讨生脉饮治疗糖尿病和心力衰竭的作用机制。

1 资料与方法

1.1 生脉饮活性化合物收集与筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）[13]对人参和五味子主要化合物成分的药物动力学性质进行评估。选择“Herb Name”，分别以“人参”“五味子”作为关键词，选取口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 的化学成分作为候选活性成分。在BATMAN-TCM 数据库（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中以“麦冬”为关键词，设置“药物-靶点”模型相似性阈值（score cutoff）≥20 和P≤0.05，检索筛选麦冬活性成分。通过PubChem 平台（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.ov/）对活性化合物分子结构进行确证，统一导入.xls 文档。

1.2 生脉饮潜在靶点预测

利用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）对所得化合物进行检索和转化操作，找出生脉饮各组分的基因靶点。采用UniProt 数据库的UniProtKB 搜索功能，输入蛋白名称（protein name）并限定物种为人（homo sapiens），将检索得到的所有蛋白校正为其官方名称（official symbol）并摘录标准基因名，获取正确的靶点信息。

1.3 糖尿病和心力衰竭靶点收集

通过 DisGeNET（http://www.disgenet.org/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）数据库收集糖尿病和心力衰竭的相关靶点，输入关键词“Heart Failure”“Diabetes Mellitus”，获得已报道与糖尿病和心力衰竭相关的靶点，去除重复基因和假阳性基因，将上述生脉饮活性成分靶点与疾病相关靶点匹配取交集，分别获得生脉饮治疗糖尿病和生脉饮治疗心力衰竭的作用靶点。

1.4 共有靶点网络构建与蛋白相互作用网络分析

分别将人参、五味子、麦冬的有效成分和作用靶点信息与糖尿病和心力衰竭的靶点信息导入Cytoscape3.6.1 软件，采用该软件的Merge 功能分别筛选出生脉饮药物成分对糖尿病和心力衰竭的作用靶点（基因）。

将筛选出的共同作用靶点（基因）与富集得到的通路作为网络的节点（node），以.xls 文档中建立的相互对应关系作为网络的连接（edge），导入String 数据库（https://string-db.org/），进行蛋白相互作用（PPI）网络构建与数据分析，利用 Cytoscape3.6.1 的CentiScaPe 插件进行网络相互作用分析，使用CytoNCA 插件筛选度值较高的靶点。通过有效成分-靶点网络图分析生脉饮治疗糖尿病和心力衰竭的作用靶点，并明确药物与通路之间的协同作用。

“自我”处于“本我”和“超我”之间，位于人格金字塔的中间层，对于“本我”和“超我”起着调节作用，换句话说“自我”是“本我”和“超我”的平衡者，是自己意识的存在和觉醒。玛丽有着支离破碎的“本我”和病态发展的“超我”，导致其在各个阶段表现出来的都是迷失的“自我”。

1.5 KEGG 通路与GO 功能富集分析

Cytoscape 软件的插件ClueGo[14]整合了KEGG 信号通路分析相关数据。本研究分别采用ClueGO 和DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）对关键靶点进行KEGG 信号通路和GO 功能富集分析，研究生脉饮治疗糖尿病和心力衰竭可能靶点的关键通路和生物学过程。

2 结果

2.1 生脉饮活性化合物及潜在靶点

通过TCMSP 分别检索到人参、五味子小分子化合物190、130 个，以OB≥30%、DL≥0.18 为条件分别筛选出具有较高活性的化合物22、8 个，去除重复化合物，共29 个。通过BATMAN-TCM 数据库筛选得到麦冬活性成分22 个，排除无靶点信息的化合物，最终筛选出18 个有效化合物。

考虑化合物含量、代谢及药理作用，对生脉饮有效化合物进行补充。人参、五味子为生脉饮的君药、佐药，其主要成分分别为人参皂苷类、五味子素类，通过文献检索两药治疗糖尿病和心力衰竭的有效成分，在已选取化合物基础上，加入3 个人参相关化合物Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Rb2、Ginsenoside Re，以及1 个五味子相关化合物Schisandrin。去除重复化合物，共获得50 个小分子化合物。通过UniProt 数据库对所得化合物经过检索和转化操作，得到生脉饮有效成分的基因靶点共3754 个。

2.2 生脉饮治疗糖尿病和心力衰竭相关靶点

通过DisGeNET 和GeneCards 数据库搜索得到糖尿病特异疾病靶点1506 个、心力衰竭特异靶点814个，选取评分值≥0.1 的相关度较高的基因，得到糖尿病特异性靶点218 个、心力衰竭特异性靶点317 个。将生脉饮各药物成分靶点分别与2 种疾病相关靶点取交集，获得生脉饮治疗糖尿病和心力衰竭的作用靶点，其中生脉饮治疗糖尿病的作用靶点109 个，生脉饮治疗心力衰竭的作用靶点196 个。

2.3 活性成分-靶点网络分析

2.3.1 生脉饮治疗糖尿病成分-靶点网络分析

运用Cytoscape3.6.1 软件构建生脉饮活性成分治疗糖尿病潜在作用靶点网络，包含133 个节点（21个活性成分、112 个作用靶点）和170 条边，见图1。

将生脉饮治疗糖尿病的靶点导入String 平台进行PPI 网络分析，结果见图2。该网络有109 个节点蛋白，1435 条相互作用连线，线条粗细代表作用强弱。利用Cytoscape3.6.1 软件的CentiScaPe 插件计算出平均度值为26.3，平均节点中心性为0.005，平均中介中心度为92.4。使用CytoNCA 插件筛选出度值居前10 位的靶点，分别为INS、IL6、ALB、TNF、PPARG、TP53、LEP、VEGFA、CAT、IGF1，表明这10 个靶蛋白是PPI 网络中最关键的靶点，在该网络中发挥重要作用，是生脉饮治疗糖尿病的主要药效靶点。

图1 生脉饮治疗糖尿病成分-靶点网络图

2.3.2 生脉饮治疗心力衰竭成分-靶点网络分析

运用Cytoscape3.6.1 软件构建生脉饮治疗心力衰竭潜在作用靶点网络，见图3。该网络包含218 个节点（19 个活性成分和199 个作用靶点）和270 条边。

将生脉饮治疗心力衰竭的靶点导入String 平台进行PPI 网络分析，结果见图4。该网络有196 个节点蛋白，2665 条相互作用连线，线条粗细代表作用强弱。利用Cytoscape3.6.1 软件的CentiScaPe 插件计算出平均度值为27.2，平均节点中心性为0.003，平均中介中心度为196.9。使用CytoNCA 插件筛选出度值前10的靶点，分别为INS、IL6、ALB、TNF、VEGFA、TP53、NOS3、PPARG、IGF1、CCL2，表明这10 个靶蛋白是PPI 网络中最关键的靶点，在该网络中发挥重要作用，是生脉饮治疗心力衰竭的主要药效靶点。

图2 生脉饮治疗糖尿病PPI 网络图

图3 生脉饮治疗心力衰竭成分-靶点网络图

图4 生脉饮治疗心力衰竭PPI 网络图

2.4 共有靶点KEGG 通路和GO 功能富集分析

2.4.1 生脉饮治疗糖尿病靶点KEGG通路和GO功能富集分析

生脉饮治疗糖尿病靶点KEGG 通路分析结果见图5。AGE-RAGE 信号通路、胰岛素抵抗信号通路、肾素分泌信号通路、脂肪细胞脂解调控信号通路、癌症通路、肌萎缩侧索硬化信号通路、胆固醇代谢信号通路、青春晚期糖尿病信号通路及PPAR 信号通路在生脉饮治疗糖尿病过程中发挥了重要作用。其中AGE-RAGE 信号通路、胰岛素抵抗信号通路、肾素分泌信号通路占比最高，预测生脉饮对这3 条通路的调节在糖尿病治疗中具有重要作用。

将生脉饮治疗糖尿病的109 个靶点信息导入DAVID 数据库进行GO 功能富集分析，生物过程部分结果见表1。稳态过程（43 个靶点）、体内化学平衡（37 个靶点）、激素刺激应答（28 个靶点）、内源性刺激应答（28 个靶点）、有机物应答（35 个靶点）排列靠前，同时还与细胞增殖调控、脂质代谢过程的正向调控、对细胞外刺激的反应等生物过程有关。

表1 生脉饮治疗糖尿病GO 功能分析生物过程部分结果

2.4.2 生脉饮治疗心力衰竭靶点KEGG通路和GO功能富集分析

生脉饮治疗心力衰竭靶点KEGG 通路分析结果见图6。钙离子信号通路、白细胞介素17 信号通路、粘着斑信号通路、萎缩侧索硬化信号通路、Apelin 信号通路、HIF-1 信号通路、受体相互作用信号通路、胰岛素抵抗信号通路、AGE-RAGE 信号通路、cAMP信号通路及Relaxin 信号通路等在生脉饮治疗心力衰竭过程中发挥重要作用。由于各通路所占百分比差距并不明显，故通过文献研究从中选取3 条主要通路探寻生脉饮治疗心力衰竭的主要机制。

图6 生脉饮治疗心力衰竭KEGG 通路饼状图

将生脉饮治疗心力衰竭的196 个靶点信息导入DAVID 数据库进行GO 富集分析，生物过程部分结果见表2。循环系统过程（41 个靶点）、血液循环（41个靶点）、系统过程调节（48 个靶点）、稳态过程（65个靶点）、化学稳态（53个靶点）排列靠前，同时还与血压调节、多细胞生物过程的负调节、细胞增殖调控等生物学过程有关。

表2 生脉饮治疗心力衰竭GO 功能分析生物过程部分结果

3 讨论

中药复方成分复杂，其药效团与作用机制一直是研究的难点。生脉饮作为中医经典名方，临床治疗作用广泛，方中人参、麦冬、五味子亦是临床使用频次甚高的药物。临床研究表明，在西医治疗基础上，以生脉饮为底方进行加减可更有效控制气阴两虚型糖尿病患者的血糖，且整体疗效确切，安全性高[15-166]。在西医常规治疗基础上，给予生脉注射液或生脉饮口服液可提高心力衰竭患者的心输出量和左室射血分数，并对改善心功能分级具有潜在益处[177]。

本研究采用网络药理学方法对生脉饮组方药物活性成分及其对应靶点进行预测，并经文献查阅与所得数据分析对比，发现生脉饮可能主要通过调节AGE-RAGE 信号通路、胰岛素抵抗信号转导通路、肾素分泌信号通路、钙离子信号通路、HIF-1 信号通路及Relaxin 信号通路等对糖尿病、心力衰竭及糖尿病合并心力衰竭达到治疗效果。因此，对以上几个主要通路的分析尤为关键。

AGE-RAGE 信号通路参与了糖尿病、肿瘤、神经性疾病等多种疾病的发生。晚期糖基化终产物（AGEs）是多种物质的总称，由于人体长期处于高血糖状态下，葡萄糖分子与体内蛋白质发生非酶糖基化反应最终形成AGEs。AGEs 可引起不同程度的胰岛β 细胞功能障碍[18]或细胞凋亡[19]，流行病学研究显示，AGEs 与胰岛素原/胰岛素存在正相关性[20]，直接提供了人群证据表明AGEs 是一种导致糖尿病发生的独立致病因素。当AGEs 与细胞表面特异性信号传导受体RAGE 结合后，还可诱导发生氧化应激反应，产生自由基，导致氧化损伤、血管收缩和促凝血状态，促进糖尿病的发生和发展[21]。AGE-RAGE 信号通路亦在心力衰竭发生、发展过程中起一定作用。有研究推测机体高浓度AGEs 可能引起心力衰竭，RAGE是介导AGEs 对心血管系统引起损害反应的主要受体，二者结合可增加心肌细胞的凋亡率[22]。当心肌细胞受损，RAGE 表达增加，与AGEs 结合后可阻碍钙离子代谢、血管收缩、心肌纤维化等，从而导致心肌收缩舒张功能障碍[23]。

胰岛素抵抗信号转导通路是由于炎性细胞因子升高，干扰胰岛素信号转导中胰岛素受体底物的正常磷酸化，阻断下游靶点激活而形成[24]。胰岛素抵抗是2 型糖尿病重要的生理病理机制，并且可以通过影响能量代谢、神经内分泌等多个途径导致心力衰竭，使心血管事件发生率增加[25]。

肾素血管紧张素系统与多种疾病的病理生理过程关系紧密，包括肾脏疾病、心血管疾病、糖尿病等。肾素和醛固酮是2 型糖尿病的关键催化因子，通过一系列酶促级联反应在糖尿病的发生发展中扮演重要角色[26]，而血糖浓度过高又可直接引起肾小球足突细胞的肾素分泌[27]。对于严重心力衰竭患者，肾素作用于血管紧张素原，生成血管紧张素，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，导致血管收缩、血压上升，加重心脏负担。

钙离子信号通路是心力衰竭发生发展的中心环节[28]。Ca2+在心肌的收缩和舒张过程中起着极为关键的作用，肌质网内Ca2+浓度下降，引起心肌收缩力减弱，促进心力衰竭发生，而心力衰竭心脏的电生理特性和收缩功能的改变均与心肌舒张过程中心肌细胞内Ca2+延迟升高有关。钙离子通道与胰岛素分泌关系密切，Ca2+是胰岛素释放的重要信号。当血糖升高时，导致胰岛β 细胞中Ca2+水平升高，从而触发胰岛素释放，当细胞无法释放正常水平的胰岛素时，此机制就会受到影响。

缺氧诱导因子（HIF）信号通路涉及广泛，已知可调节数以百计的基因表达，在多种心血管疾病、炎症、癌症与急性脏器损伤等过程中发挥重要作用[29]。其中，HIF-1 蛋白能够促进血管新生、改善无氧代谢、增强免疫应答、促进红细胞生成以及维持内环境稳态。血管内皮生长因子（VEGF）是HIF-1 最典型的靶基因，心肌缺血后，HIF-1 调控VEGF 的表达，促进心肌中血管生成，改善心肌供血供氧，对心肌组织侧支循环的建立有重要意义[30]。而在心力衰竭晚期，HIF-1α 长期慢性表达则会加重压力超负荷所致的心肌重构和心力衰竭，增强对心脏的恶化作用[31]。另有实验研究表明，糖尿病会影响HIF-1 活性，导致众多下游靶基因表达减少或功能减退，影响血液循环并导致伤口愈合障碍[32]。

松弛素信号转导通路的激活是由松弛素与其受体结合后，受体发生构象改变，细胞外片段末端与跨膜亚单位发生作用而产生的[33]。松弛素由心脏分泌释放，对心血管事件的预后具有预测作用，尤以严重的心力衰竭最为显著[34]，并具有舒张血管、抗心肌重构、抗心肌缺血、抗炎等作用[35]。临床研究表明，松弛素有利于缓解急性心力衰竭和呼吸困难等临床症状，具有良好的安全性和耐受性[36]。另有数据显示，外源性松弛素给药可改善糖尿病患者的胰岛素敏感性，科学界正在探索松弛素在糖尿病及其并发症中可能的有益作用[37]。

本研究通过对有效靶点进行KEGG 通路分析发现，生脉饮主要通过调控AGE-RAGE 信号通路、胰岛素抵抗信号通路、肾素分泌信号通路等通路治疗糖尿病，通过调控钙离子信号通路、缺氧诱导因子信号通路及松弛素信号转导通路等通路治疗心力衰竭，而调节上述各通路对糖尿病和心力衰竭及二者共病均有相应的调控作用。可以看出，生脉饮作用范围十分广泛，且能通过不同的调节方式对相应信号通路产生作用而达到对某类疾病的干预目的。笔者认为，生脉饮对信号通路的调节十分复杂，可能通过激素、细胞代谢、炎症及免疫因子等多种信号通路作用于糖尿病和心力衰竭。另外，本研究尚未对麦冬多糖、五味子多糖等大分子复合成分及有待发掘的药效团进行分析，因此，对于何种成分以何种方式作用于具体靶基因及各通路调节机制等应继续深入研究。基于网络药理学的作用机制探索为治疗糖尿病与心力衰竭提供了重要线索，同时可为中医“异病同治”机制研究提供新的探索方向。