槲皮素对糖尿病肾病大血管病变大鼠体内TGF-β1、MT-1和α-SMA水平的影响

李军，贾永康，张秋艳，符宇

（1.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450000；2.郑州人民医院，河南 郑州 450003；3.郑州市骨科医院，河南 郑州 450003；4.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450046）

近年来，随着我国的高速发展，国民的经济水平逐渐提高，人们的生活质量也不断改善，同时也导致糖尿病的患病人数逐年增长。糖尿病肾病患者发病早期会导致肾小球萎缩，且滤过率也会出现异常，此异常是导致患者出现大血管病变的主要危险因素［1］，大血管病变则会导致脑炎与心血管疾病等［2］。糖尿病肾病会影响肾脏的正常工作，晚期时会引发肾衰竭，使肾功能无法发挥正常作用，而心血管疾病则是导致肾衰竭患者死亡的重要发病机制［3］。相关研究表明，糖尿病肾病引发心血管疾病的患者会出现高血压、贫血等症状，且会使炎性因子的表达升高，使患者的炎症情况加重［4］。糖尿病肾病大血管病变是一种较为严重的疾病，治疗时多用西药，其药效较快，有较为明显的效果，但西药会产生一定的不良反应，给患者在治疗过程中增加了不必要的困扰。中医学对于糖尿病肾病的认知有着较多的历史经验，认为“消渴病肾病”主要发生的原因是“气”消耗过多伤到了“阴”，以致肾气血虚弱，较常出现的症状为气短、无力、腰膝酸软等。槲皮素属于黄酮醇类化合物，具有抗炎作用，能抑制患者体内炎症因子，使患者的免疫力得到增强，槲皮素对肾脏有一定的保护作用，但其对糖尿病肾病大血管病变的作用机制研究较少［5］。本研究通过建立动物模型，探讨槲皮素对于糖尿病肾病大血管病变大鼠治疗作用以及对于TGF-β1、MT-1和α-SMA水平的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

选取健康大鼠40 只（辽宁长生生物公司），大鼠5～6 周龄，体质量212～235 g。饲养实验室温度23.5～27.3 ℃，相对湿度52%～62%，正常光照，常规喂养1周后开始实验。将大鼠随机分为4组，其中正常组（TT 组）10 只、模型组（JJ 组）10 只、槲皮素低剂量组（DH 组）10只给予50 mg/（kg·d）槲皮素干预、槲皮素高剂量组（GH组）10只给予100 mg/（kg·d）槲皮素干预。

1.2 实验试剂与器械

链脲佐菌素STZ（宝鸡市辰光生物公司）；槲皮素（河南莱尔茵生物公司）；TGF-β1试剂盒（武汉纯度生物公司）；MT-1试剂盒（济南千司生物公司）；α-SMA试剂盒（济南千司生物公司）；全自动生化分析仪（济南千司生物公司）；水合氯醛（佛山信航生物公司）；GSH试剂盒（上海研谨生物公司）；IL-6 试剂盒（泉州市九邦生物公司）。

1.3 模型建立

TT 组大鼠给予正常饮食；其余各组大鼠给予高糖、高脂饮食饲养8 周后，禁食1 d。JJ 组、DH 组及GH组大鼠腹部注射2% STZ，每日注射量60 mg/kg；TT 组大鼠注射同等剂量生理盐水，3 d后，测量血糖浓度，当血糖浓度≥16.7 mmol/L，尿蛋白＞30 mg/L 时，视为糖尿病肾病成功建模。检查其胸主动脉弓的病理变化，若其主动脉血管内皮细胞损伤严重，且其与内弹力板连接处间隙扩大，则证明糖尿病肾病大血管病变模型建模成功。DH 组与GH 组用槲皮素溶液灌胃，每日1次，共7次。

1.4 检测指标

1.4.1 血压

运用ZH-HX-Z 型无创伤血压测定仪测定大鼠舒张压（DBP）、平均血压（MBP）和收缩压（SBP）。

1.4.2 甘油三酯、尿素氮、总胆固醇水平

各组大鼠禁食12 h 后，于清晨尾部静脉多次取血共2 mL，然后以2 500 r/min的速度离心10 min，取上清液，用全自动生化分析仪检测大鼠甘油三酯、尿素氮、总胆固醇水平。

1.4.3 血清中GSH、IL-6的含量

以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取颈部动脉血，以2 500 r/min 的速度离心10 min，取上清液。按照GSH、IL-6试剂盒方法检测GSH与IL-6水平。

1.4.4 肾组织的病理变化

治疗结束后，麻醉处死大鼠，取各组大鼠肾组织，经甲醛固定24 h 后酒精脱水。二甲苯透明浸蜡后，常规切片，HE染色后用显微镜观察。

1.4.5 Western Blot 法检测TGF-β1、MT-1 和α-SMA蛋白情况

取大鼠主动脉标本，将血管剪碎后置匀浆套管中，加入1 mL 裂解液进行裂解并提取蛋白，并对蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在-20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液按4∶1 的比例进行混匀，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。把电泳后的50 μg蛋白样品转移至PVDF 膜上，加脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗后使用TTBS 漂洗3 次，每次漂洗10 min，最后加入二抗对溶液进行稀释，常温封闭1 h。取出PVDF 膜，漂洗3 次，每次间隔10 min，DAB显色后照相。严格按照TGF-β1、MT-1 和α-SMA试剂盒说明操作，计算其蛋白表达含量。

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0 统计学软件进行分析。大鼠α-SMA、TGF-β1 和MT-1 蛋白表达等指标采用方差分析，不同组之间比较采用t检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血压比较

JJ 组大鼠DBP、SBP、MBP 高于TT 组（P＜0.05）；DH 组、GH 组大鼠血压较JJ 组明显降低（P＜0.05）；GH 组大鼠DBP、SBP、MBP 血压值低于DH 组（P＜0.05）。说明槲皮素可降低糖尿病肾病大血管病变大鼠血压，且随着槲皮素剂量的增加血压降低越明显。见表1和图1。

表1 各组大鼠血压检测结果比较（±s，mm Hg）

表1 各组大鼠血压检测结果比较（±s，mm Hg）

注：与TT 组比较，*P＜0.05；与JJ组比较，#P＜0.05；与DH 组比较，@P＜0.05。

MBP 93.25±4.57 141.11±11.24*129.38±6.37*#95.17±5.26*#@108.60＜0.001组别TT组JJ组DH组GH组F值P值n 10 10 10 10 DBP 81.36±5.67 127.32±9.24*112.73±6.59*#88.61±4.13*#@101.90＜0.001 SBP 112.21±11.53 162.21±13.67*145.54±5.37*#115.39±7.14*#@58.39＜0.001

图1 各组大鼠血压检测结果比较

2.2 各组大鼠血清甘油三酯、尿素氮和总胆固醇水平比较

JJ组大鼠血清中甘油三酯、尿素氮和总胆固醇水平高于TT组（P＜0.05）；与JJ组相比，DH组、GH组大鼠血清中甘油三酯、尿素氮和总胆固醇水平降低（P＜0.05）；GH组大鼠血清中甘油三酯、尿素氮和总胆固醇水平明显低于DH组（P＜0.05）。说明槲皮素可降低糖尿病肾病大血管病变大鼠血清中甘油三酯、尿素氮和总胆固醇水平，且剂量越大效果越明显。见表2和图2。

表2 各组大鼠甘油三酯、尿素氮和总胆固醇表达水平比较（±s，mmol/L）

表2 各组大鼠甘油三酯、尿素氮和总胆固醇表达水平比较（±s，mmol/L）

注：与TT 组比较，*P＜0.05；与JJ组比较，#P＜0.05；与DH 组比较，@P＜0.05。

总胆固醇3.68±0.35 6.74±0.13*4.22±0.07*#3.32±0.08*#@633.50＜0.001组别TT组JJ组DH组GH组F值P值n 10 10 10 10甘油三酯1.15±0.13 3.27±0.14*1.72±0.07*#1.32±0.04*#@869.20＜0.001尿素氮3.89±0.14 8.16±0.13*4.61±0.32*#4.25±0.21*#@854.30＜0.001

图2 各组大鼠甘油三酯、总胆固醇和尿素氮表达水平比较

2.3 各组大鼠血清中GSH、IL-6的表达比较

与TT 组相比，JJ 组大鼠血清中GSH 水平降低，IL-6 水平升高（P＜0.05），与JJ 组相比，DH 组、GH 组大鼠血清中GSH 水平升高，IL-6 水平降低（P＜0.05）；GH组GSH水平高于DH组（P＜0.05），IL-6水平低于DH 组（P＜0.05）。说明槲皮素可影响GSH、IL-6 水平，且随着剂量的增加各组大鼠血清中GSH、IL-6表达水平改善越明显。见表3和图3。

图3 各组大鼠血清中GSH、IL-6水平比较

表3 各组大鼠血清中GSH、IL-6的表达比较（±s）

表3 各组大鼠血清中GSH、IL-6的表达比较（±s）

注：与TT 组比较，*P＜0.05；与JJ组比较，#P＜0.05；与DH 组比较，@P＜0.05。

IL-6（ng/L）63.21±7.42 91.71±11.86*73.25±7.57*#67.41±7.12*#@20.81＜0.001组别TT组JJ组DH组GH组F值P值n 10 10 10 10 GSH（mmol/L）19.75±1.28 12.53±4.27*17.05±3.26*#18.82±2.37*#@12.34＜0.001

2.4 HE染色观察大鼠肾组织的病理变化

TT 组的肾组织的细胞排列有序，肾小球内的细胞数量正常；JJ组肾组织细胞排序较为混乱，其肾小球内的细胞发生改变，数量减少；DH 组与GH 组肾组织内的细胞有序排列且其肾小球内的细胞数量均较JJ 组有所增加，GH组效果更优。见图4。

图4 大鼠肾组织病理变化（HE染色，×400）

2.5 各组大鼠主动脉样本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1蛋白表达比较

JJ 组大鼠主动脉样本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1蛋白表达皆高于TT组（P＜0.05）；与JJ组相比，DH 组、GH 组大鼠上述蛋白均显著降低（P＜0.05）；DH 组大鼠主动脉样本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1蛋白表达高于GH 组（P＜0.05）。说明高剂量的槲皮素可有效抑制α-SMA、TGF-β1 和MT-1 蛋白表达。见表4和图5。

图5 各组大鼠主动脉样本中α-SMA、TGF-β1、MT-1蛋白表达比较

表4 各组大鼠α-SMA、TGF-β1和MT-1水平比较（±s）

表4 各组大鼠α-SMA、TGF-β1和MT-1水平比较（±s）

注：与TT 组比较，*P＜0.05；与JJ组比较，#P＜0.05；与DH 组比较，@P＜0.05。

MT-1 3.68±0.35 6.74±0.13*4.22±0.07*#3.32±0.08*#@950.30＜0.001组别TT组JJ组DH组GH组F值P值n 10 10 10 10 α-SMA 1.15±0.13 3.27±0.14*1.72±0.07*#1.32±0.04*#@1 304.00＜0.001 TGF-β1 3.89±0.14 8.16±0.13*4.61±0.32*#4.25±0.21*#@1 281.00＜0.001

3 讨论

随着糖尿病的发生，其带来的并发症也随之增加，糖尿病肾病大血管病变就是其中的一种。糖尿病肾病大血管病变的发病时间较长，过程较为缓慢，主要是由于糖尿病患者代谢紊乱使血管以及血管内皮细胞内的超氧化物生长过多，ROS 在细胞内快速增加阻碍血管的生成，血管出现缺血等现象，这使得患者体内炎性因子增加，令患者体内的炎症加重。新血管生成的紊乱则会使患者的毛细血管变得通透，从而出现斑块破裂等现象，加重患者病情［6-9］。糖尿病肾病的主要病因为患者病情加重伤及肾脏，使肾脏不能正常工作，且患者由于糖尿病的加重还会引起血糖、血脂等的紊乱。引发糖尿病肾病大血管病变的原因多样，不仅与炎症增加有直接关系，与蛋白质非酶糖基化等也有密切联系［10］。其大血管病变涉及主动脉、肌性动脉等，最为熟知的是动脉粥样硬化发病率在糖尿病患者中高出数倍，也是由于糖尿病肾病患者的大血管病变产生的。相关研究发现，中药可以对糖尿病肾病患者的治疗带来一定的疗效［11-13］。

根据本研究发现，JJ组大鼠血清中甘油三酯、尿素氮、总胆固醇、血压及IL-6均高于TT组；与JJ组相比，DH 组、GH 组甘油三酯、尿素氮、总胆固醇、血压及IL-6均有所降低，且给予高剂量槲皮素干预的大鼠体内甘油三酯、尿素氮、总胆固醇、血压及IL-6 水平改善优于低剂量槲皮素，说明槲皮素可对IL-6 产生抑制作用。胆固醇是合成肾上腺皮质激素、性激素等维持正常生理生活的重要物质，也是构成细胞膜的主要成分，其升高会导致粥动脉硬化、糖尿病和肾病综合征等。甘油三酯过高会导致血液中的脂质含量过高，血液的黏稠物质在血管壁内沉淀形成块状，引发动脉粥硬化；在肾脏表达过多则会使肾脏受损，严重会导致肾衰竭。尿素氮的敏感性较差，在肾小球滤过率降低到50%以下时就会出现，尿素氮的增加会引起肾脏缺血、血容量不足、急性肾炎、脱水、消化道出血等。肾脏是血液供应最丰富的一个器官，长期承受高血压会使肾脏血管变硬或变细，进而使肾脏发生萎缩。IL-6是一种多效的细胞因子，它可以使胰岛B细胞受到损伤，并降低其功能，诱导机体产生胰岛素抵抗；还可以损伤肾小球，产生尿蛋白［14］。过高的尿蛋白会使肾小球重吸收的负担加重，导致肾小管萎缩，产生高脂血症。GSH在人体的每个细胞中都有体现，是一种活性肽，可调节人体的免疫功能。徐丽娜等［15］研究证实，给予不同剂量的槲皮素对子宫内膜细胞损伤模型大鼠进行干预，结果表明随着槲皮素浓度的升高，大鼠体内IL-6 等炎性物质水平明显降低。杨晓琳等［16］通过实验发现，槲皮素具有降低血糖、抗氧化应激、抗炎和抑制肾脏纤维化等作用机制，能够对肾脏起到保护作用。

本研究发现，JJ 组大鼠主动脉样本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1 蛋白表达皆高于TT 组（P＜0.05）；与JJ 组相比，DH 组、GH 组大鼠上述蛋白均显著降低；DH 组大鼠主动脉样本中α-SMA、TGF-β1 和MT-1蛋白表达高于GH 组。说明高剂量的槲皮素能有效地抑制α-SMA、TGF-β1 和MT-1 蛋白表达。α-SMA的异常表达会引起血管钙化，血管钙化是肾衰竭晚期患者的并发症。糖尿病的主要并发症是血管壁纤维化，血管壁纤维化主要表现为血管管腔直径缩小，动脉壁加厚。TGF-β1 可促进成纤维细胞的增殖，可通过消除纤维化发展过程中病变组织产生过多的TGF-β1进行血管壁纤维化的治疗。MT-1可降低动脉粥样硬化的病变程度并保护血管免于受到损伤。高血糖会使蛋白糖基化增加并在人体组织中堆积，从而通过改变肾小球基底膜的组织结构等使肾小球硬化，使肾脏受到损伤出现功能紊乱，难以正常工作，肾脏受损后其肾组织内α-SMA、TGF-β1 和MT-1 的蛋白表达较正常肾组织中的表达升高，这使得肾小球滤过率增加，成纤维细胞的增长加快，从而加重肾功能的损伤［17］。α-SMA 可反映平滑肌细胞的数量及其收缩能力。TGF-β1 是导致肾间质纤维化的重要因素，其主要作用机制为增加肾小球系膜区细胞外基质的合成、积聚，导致肾小球硬化，肾功能衰竭。槲皮素干预后可使糖尿病肾病大血管病变大鼠体内TGF-β1、MT-1和α-SMA 蛋白的表达量降低［18］。KIMURA 等［19］研究表明，α-SMA、MT-1 和TGF-β1 在糖尿病肾病患者中表达过高。户庆峰等［20］研究表明，槲皮素可能通过下调TGF-β1、MCP-1 的表达改善系统性红斑狼疮小鼠肾功能。槲皮素可通过抑制超氧阴离子发生反应，抑制自由基产生，阻碍其参与促糖化过程，具有较强的抗氧化作用［21］。也有研究发现槲皮素可参与糖化，和氧化荧光产物之间存在密切相关联系，改善血管病变主要与可抑制TGF-β1、AGEs 和MDA有关［22］。

综上所述，槲皮素对于糖尿病肾病大血管病变大鼠有一定正向促进作用，其作用机制与降低α-SMA、MT-1指标和改善炎性水平有关。