胎盘CD68、PD⁃1、IL⁃10与妊娠并HCV感染关系及对母婴结局的影响

李瓅 周亚丹 高利伟

相关研究显示，母婴垂直传播是慢性丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染患儿的重要传播途径之一［1⁃4］，发生风险可达10%［5］，多通过宫内、产道感染。HCV 母婴传播机制较为复杂，研究已证实机体固有免疫、获得性免疫共同参与HCV感染过程［6］。鉴于胎盘组织中免疫机制在妊娠并HCV 感染中的作用尚未完全明确，本研究综合分析胎盘CD68、PD⁃1、IL⁃10 与妊娠并HCV 感染关系及对母婴结局的影响，报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取本院2016年10月至2019年10月妊娠并HCV 感染患者116 例作为观察组，另选取同期正常妊娠孕妇58 例作为对照组。纳入标准：①观察组产前均经酶联免疫吸附试验（ELISA）法、荧光定量PCR 法检测显示HCV 呈阳性；②对照组产前均经血清学ELISA 法、荧光定量PCR 法等检测显示HCV 呈阴性；③两组均为单胎妊娠；④患者及家属均签署知情同意书。排除标准：①近期有HCV 相关治疗者；②爆发性肝衰竭黄疸者；③药物性肝炎或乙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒等其他病毒性肝炎者。两组基本资料均衡可比（P>0.05），见表1。本研究经院医学伦理委员会审批同意。

1.2 方法

1.2.1 胎盘IL⁃10 检测方法

胎盘娩出后，5 min 内严格遵照无菌操作规范采集1 cm3母体面脐带根部胎盘组织：生理盐水冲洗2～3 次后，电子天平称重，加入生理盐水50 mg/mL，低温环境下手动研磨标本、生理盐水混合液，均匀后加入2.5 mL EP 管内，3 000 r/min，4℃低温离心20 min，收集上清液，-70℃保存待检。采用ELISA 法检测胎盘组织匀浆中IL⁃10 水平，试剂盒购自上海岚派生物科技有限公司。

表1 两组一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general data between two groups（±s）

表1 两组一般资料比较（±s）Table 1 Comparison of general data between two groups（±s）

组别观察组对照组t 值P 值n 116 58年龄（岁）30.19±1.50 29.86±1.35 1.413 0.159体质量（kg）62.89±4.02 63.11±4.24 0.334 0.739孕周（周）39.15±0.40 39.21±0.46 0.887 0.377孕次（次）1.48±0.13 1.51±0.17 1.291 0.198新生儿体质量（kg）3.20±0.35 3.15±0.29 0.938 0.349

1.2.2 胎盘CD68、PD⁃1 检测方法

采用全自动免疫组化染色仪（型号：MY⁃AU60）以免疫组织化学染色法测定胎盘CD68、PD⁃1阳性细胞数，仪器及试剂盒均购自上海永创医疗器械有限公司，石蜡包埋，切片，二甲苯梯度脱蜡，酒精梯度脱水，微波抗原修复，使用双氧水（H2O2，3%）清除内源性过氧化物酶，滴加抗体，显色，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。判读标准［7］：光学显微镜下探查切片染色情况，细胞浆及细胞核内有棕黄色颗粒视为阳性，并根据染色强度进行分级。0 分，胞内无染色、染色不清，与背景颜色一致，均为均匀淡黄色；1分，细胞浆及细胞核内可见少量淡黄色颗粒，并超出背景颜色；2 分，细胞浆及细胞核内可见较多深棕色颗粒；3 分，细胞浆及细胞核内可见大量深棕色颗粒。阳性细胞百分率：无阳性细胞为0 分；阳性细胞百分率＜25.0%为1 分；25.0%≤阳性细胞百分率≤50.0%为2分；阳性细胞百分率＞50.0%为3分。染色强度分级与阳性细胞百分率分级相乘积分≥2分表示阳性表达。

1.2.3 HCV 载量检测方法

采用全自动PCR 检测仪（型号：SLAN®⁃48P）以RT⁃PCR 法检测HCV 载量，仪器及试剂盒均购自上海宏石医疗科技有限公司，严格按照仪器、试剂盒说明书执行。

1.3 观察指标

①比较两组胎盘CD68、PD⁃1阳性细胞数及IL⁃10水平。②观察组不同病毒载量患者胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数及IL⁃10 水平。③比较两组母婴结局。④观察组不同胎盘CD68、IL⁃10、PD⁃1 表达患者母婴结局。⑤分析胎盘CD68、IL⁃10、PD⁃1 与HCV 病毒载量相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件处理数据；符合正态分布计量资料以（）表示，两两比较采用t检验，偏态分布数据以M（P25⁃P75）表示，组间比较用Mann⁃Whitney U 检验；计数资料用n（%）表示，行χ2检验；采用Pearson 进行线性相关性分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数及IL⁃10 水平比较

观察组胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数低于对照组，IL⁃10 高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2、图1。

2.2 观察组不同HCV 病毒载量患者胎盘CD68、IL⁃10、PD⁃1 水平比较

观察组116 例妊娠并HCV 感染患者平均HCV 病毒载量为（5.18±0.75）l gIU/mL。根据此水平分为高病毒载量患者与低病毒载量患者。高病毒载量患者胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数低于低病毒载量患者，IL⁃10 高于低病毒载量患者，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

表2 两组胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数及IL⁃10 水平比较Table 2 Comparison of placenta CD68，PD⁃1 positive cells and IL⁃10 levels in placenta between the two groups

图1 胎盘CD68、PD⁃1 免疫组织化学染色图（SP，×200）Figure 1 immunohistochemical staining of placenta CD68 and PD⁃1 in placenta（SP，×200）

2.3 两组母婴结局比较

观察组产妇、新生儿不良结局发生率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.4 观察组不同胎盘CD68、IL⁃10、PD⁃1 表达患者母婴结局比较

根据观察组胎盘CD68、IL⁃10、PD⁃1 表达均数为界，分为高表达、低表达患者。胎盘CD68、PD⁃1高表达患者产妇、新生儿不良结局发生率低于低表达患者，IL⁃10 高表达患者产妇、新生儿不良结局发生率高于低表达患者，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

2.5 胎盘CD68、IL⁃10、PD⁃1 与HCV 病毒载量相关性

胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数与HCV 病毒载量呈负相关（r1=-0.741，P1＜0.001；r2=-0.644，P2＜0.001），IL⁃10 水平与HCV 病毒载量呈正相关（r3=0.561，P3＜0.001），见图2。

表3 两组胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数及IL⁃10 水平比较Table 3 Comparison of placenta CD68，PD⁃1 positive cells and IL⁃10 levels in placenta of two groups

表4 两组产妇结局比较［n（%）］Table 4 Comparison of maternal and neonatal outcomes between 2 groups［n（%）］

表5 观察组不同胎盘CD68、IL⁃10、PD⁃1 表达患者产妇及新生儿结局比较［n（%）］Table 5 Comparison of maternal and neonatal outcomes of patients with different placental CD68，IL⁃10 and PD⁃1 expression in observation group［n（%）］

图2 胎盘CD68、IL⁃10、PD⁃1 与HCV 病毒载量相关性Figure 2 Correlation between placenta CD68，IL⁃10，PD⁃1 and HCV viral load in placenta

3 讨论

本研究通过免疫组织化学染色法可知，观察组胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数低于对照组。提示胎盘CD68、PD⁃1 可能参与妊娠并HCV 患者发生、发展。CD68 是一种以巨噬细胞为主的炎症细胞，在细胞摄粒作用、溶酶体运输过程中扮演重要角色［8］。PD⁃1 及其主要配体PD⁃L1 是负性共刺激信号之一，可负向调控T 细胞介导的免疫反应，甚至形成免疫耐受［9］。提示HCV 感染一定程度会降低胎盘免疫功能，引发自身免疫应答，进而抑制胎盘CD68、PD⁃1 表达，而胎盘CD68、PD⁃1 低表达会破坏胎儿抵御病原体侵入的第一层免疫屏障，难以识别病毒，从而导致病毒免疫逃逸，诱发HCV 持续感染。另外，本研究还发现，高病毒载量妊娠并HCV 患者胎盘CD68、PD⁃1 阳性细胞数低于低病毒载量患者，可能归因于HCV 分泌相关病毒抗原激活肝脏免疫抑制效应，导致巨噬细胞出现低反应性，影响抗原提呈过程，进而为HCV 藏匿、复制提供场所及传播媒介，增加HCV 垂直传播风险［10］。本研究进一步分析，胎盘CD68 高表达患者产妇、新生儿不良结局发生率低于低表达患者，这可能是由于母体肝脏共同承担产妇及胎儿解毒及代谢作用，而胎盘CD68 低表达可能会引发HCV 持续感染，加重肝功能损伤，降低醛固酮灭活能力，增加子宫收缩频率、程度，进而增加产妇、新生儿不良结局发生风险。然而，胎盘PD⁃1 低表达对妊娠并HCV 感染患者母婴结局的影响机制尚未完全明确，结合既往研究结果［11］推测可能与PD⁃1/PD⁃L1信号通路调节Treg/Th17 细胞平衡，引发母胎免疫耐受有关。

病毒感染者外周血中存在Th1/Th2 偏移现象，主要表现为Th2 型免疫应答。本研究经ELISA 法检测发现，高病毒载量患者胎盘IL⁃10 高于低病毒载量患者，可见胎盘IL⁃10 表达与妊娠并HCV 感染病毒载量存在一定关系。IL⁃10 是母胎界面最主要的Th2 型细胞因子，既可促进Th2 分化增殖，又能抑制Th1 分化增殖。这可能归因于胎盘IL⁃10水平上调通过免疫抑制，导致Th1/Th2 细胞因子平衡偏移，从而抑制HCV 特异性免疫应答，减弱机体抗炎及抗病毒能力，增加胎盘HCV 病毒清除难度，引发HCV 感染。本研究还指出，胎盘IL⁃10 高表达患者产妇、新生儿不良结局发生率高于低表达患者，这可能归因于胎盘IL⁃10 高表达一方面可促使胎盘大量分泌肿瘤坏死因子⁃α，增加胎盘局部及血循环中炎症浓度，进而增强免疫排斥反应，降低母体免疫耐受，影响产妇结局；另一方面机体Th1/Th2偏移，可抑制肝细胞能量代谢，加重肝脏功能损伤，增强母体对胎儿免疫排斥，导致围产儿死亡。

综上可知，胎盘CD68、PD⁃1 表达下降、IL⁃10 表达升高可能参与胎盘抗病毒免疫，诱导妊娠并HCV感染持续存在，从而对母婴结局产生不良影响。