芪苓益肾颗粒高效液相色谱指纹图谱物质基准研究及7种成分含量测定

王隆隆，杨忠杰，张海风，陈恒文，杜跃亮，吴作敏，王韵旨，宁萌，于晓涛*（.漯河市中心医院，河南 漯河 46300；. 中国中医科学院广安门医院，北京 00000）

芪苓益肾颗粒由黄芪、当归、茯苓、枸杞子4 味药材组成，是根据经典名方《当归补血汤》结合本院长期临床应用加减形成的有效临床验方，进而研制而成的新制剂，具有益气养血、健脾益肾等功效，临床用于气血两亏、脾肾不足所知的头晕目眩、面色萎黄、食少纳差、气短无力、病后体虚。对肿瘤化疗后白细胞减少、慢性肾功能不全、蛋白尿等疗效显著。

目前中药新药研发较为困难，其难点就在于不同产地、批次的中药饮片对复方中物质基准的影响不易控制[1-4]。而中药复方指纹图谱注重完整性，中药化学模式识别强调差异性，两者结合即保证了中药数据的完整性又能揭示不同批次间的差异[5-7]，可为中药质量的控制提供标准。因此，本研究应用HPLC 法建立15 批芪苓益肾颗粒的指纹图谱，通过指纹图谱相似度评价，并结合聚类分析（CA）、主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLSDA）法，综合比较不同批次间的差异并查找产生差异的因素，同时对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、藁本内酯7 种成分进行含量测定，为芪苓益肾颗粒的开发和质量控制提供参考，进一步为制剂工艺及药效研究提供依据[8-11]。

1 材料

高效液相色谱仪（日本岛津LC-20AD 型，包括二元泵，全波长紫外检测器，柱温箱，自动进样器，工作站）；DHG-9070 型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SB25-12D超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；FW-80 型微型高速万能试样粉碎机（天津市工兴电器厂）；AUW-120D 型十万分之一电子天平（日本SHIMADZU 公司）；Milli-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；5810R 高速离心机（美国Eppendorf 公司）。

对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：111920-201606，纯度：97.6%）、阿魏酸（批号：110773-201614，纯度：99.0%）（中国食品药品检定研究院）；洋川芎内酯Ⅰ（批号：DSTDY000901，纯度：99.45%）、芒柄花苷（批号：DSTDC004401，纯度：98.99%）、毛蕊异黄酮（批号：DST-18120901，纯度：99.84%）、芒柄花素（批号：DST-19033005，纯度：99.03%）、藁本内酯（批号：DST190315-007，纯度：98.52%）（成都德思特生物科技有限公司）；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国Fisher 公司）；磷酸为色谱纯（天津科密欧化学试剂有限公司）；乙醇为分析纯；水为饮用水或超纯水。

制备15 批芪苓益肾颗粒所用的中药饮片均来自道地药材主产区或栽培品主产区，具体信息见表1。经郑州大学药学院贾陆教授鉴定，黄芪为豆科植物蒙古黄芪（Astragalus mongholicusBunge）的干燥根；当归为伞形科植物当归（Angelica sinensis）的干燥根，茯苓为多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]的干燥菌核，枸杞子为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarumL.的干燥成熟果实，均符合2020年版《中国药典》一部相关项下规定。

表1 15 批芪苓益肾颗粒药材产地信息Tab 1 Origin of 15 batches of Qiling Yishen granules

2 方法与结果

2.1 色谱条件[11-12]

采用GL Sciences ODS-3（5 μm，4.6 mm×250 mm，UP）色谱柱，以（0.05%磷酸-水）（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0 ～10 min，11%B；10 ～40 min，11% ～27%B；40 ～50 min，27%B；50 ～65 min，27% ～40%B；65 ～75 min，80%B；75 ～80 min，80%B；80 ～81 min，80% ～11%B；81 ～100 min，11%B）；柱温35℃；进样量10 μL；流速1 mL·min－1，检测波长254 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、藁本内酯对照品适量，加甲醇分别制成质量浓度为1.86、1.92、1.75、2.14、2.02、1.96、1.42 mg·mL－1的对照品储备液；精密量取上述各储备液适量，混匀，制得各成分质量浓度为181.18、20.04、17.10、24.60、44.82、29.24、50.42 μg·mL－1的混合对照品溶液（纯度均已折算），密封保存。

2.2.2 供试品溶液 依据芪苓益肾颗粒处方称取饮片，按工艺方法制备S1 ～S15 共15 批芪苓益肾颗粒，为干燥细粉。取样品5 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加50%甲醇30 mL，超声0.5 h，用50%甲醇补足失重，13 000 r·min－1离心3 min，取上清液为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液 分别制备缺黄芪、当归、茯苓、枸杞子的阴性样品细粉，参照“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 精密度试验 取芪苓益肾颗粒供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6 次，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均≤1.0%，各色谱峰相对峰面积的RSD均≤1.6%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取芪苓益肾颗粒样品（样品S11），平行制备供试品溶液6 份，按“2.1”项下色谱条件测定，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均≤0.9%，各色谱峰相对峰面积的RSD均≤1.1%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取芪苓益肾颗粒供试品（样品S11）适量，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、6、9、24、48 h 测定，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD均≤1.0%，各色谱峰相对峰面积的RSD均≤2.0%，表明供试品在48 h 内稳定。

2.4 芪苓益肾颗粒HPLC 指纹图谱研究

按“2.2.2”项下方法制备15 批芪苓益肾颗粒供试品溶液（S1 ～S15），按“2.1”项下色谱条件测定，记录各色谱图。

2.4.1 参照峰的选定 在15 批芪苓益肾颗粒供试品溶液色谱图中毛蕊异黄酮葡萄糖苷保留时间适中、峰面积大且稳定、分离度高，故以毛蕊异黄酮葡萄糖苷为参照峰[13]。

2.4.2 相对保留时间和相对峰面积 计算15 批芪苓益肾颗粒指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果显示，各共有峰保留时间的RSD均小于0.22%，表明15 批样品共有峰的出峰时间相对稳定；各共有峰峰面积RSD相差较大，说明芪苓益肾颗粒各成分批次间存在差异。

2.4.3 芪苓益肾颗粒HPLC 指纹图谱相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”对15 批芪苓益肾颗粒供试品色谱图进行分析。以S11 为参照图谱（采用中位数法、时间宽度为0.1 min），进行多点校正和峰匹配，15 批芪苓益肾颗粒HPLC 色谱图及对照图谱叠加图，见图1。共标定了22 个共有峰，以对照图谱为参照进行相似度计算，15 批供试品的相似度均大于0.93，分别为0.975、0.939、0.938、0.939、0.984、0.986、0.972、0.99、0.983、0.988、0.985、0.986、0.987、0.982、0.981。表明所建立的芪苓益肾颗粒指纹图谱质量稳定，可以反映其指纹特征。

图1 15 批芪苓益肾颗粒HPLC 指纹图谱和对照指纹图谱（R）Fig 1 HPLC fingerprint and control fingerprint （R）of 15 batches of Qiling Yishen granules

2.4.4 芪苓益肾颗粒共有峰化学成分指认及归属 取芪苓益肾颗粒供试品溶液、阴性样品溶液、混合对照品液进样分析，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见图2。经与化学对照品色谱（S6）、当归阴性色谱（S1）、茯苓阴性色谱（S2）、枸杞子阴性色谱（S3）、黄芪阴性色谱（S4）及供试品色谱（S5）比较共指认了18 个色谱峰，分别为峰6、峰11（阿魏酸）、峰13、峰16（洋川芎内酯Ⅰ）及峰21（藁本内酯）归属于当归，峰1、峰3、峰9 及峰12 归属于茯苓，峰5 归属于枸杞子，峰2、峰10（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、峰14 ～15、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊异黄酮）、峰19、峰20（芒柄花素）归属于黄芪。

图2 芪苓益肾颗粒共有峰化学成分指认及归属HPLC 图Fig 2 HPLC of chemical composition identification and attribution of common peaks of Qiling Yishen granules

2.4.5 聚类分析（CA） 采用z-score 标准化法将15 批芪苓益肾颗粒供试品22 个共有峰的峰面积进行数据处理，将处理后数据导入SPSS 21 数据分析软件进行聚类分析[16-17]，测量区间为平方欧氏距离，聚类结果见图3。当平方欧式距离为9时，可将15 批芪苓益肾颗粒样品分为两类，其中S1、S2、S3、S4、S5、S6 聚合为一类，其余样品聚为一类。聚类结果表明，不同批次样品存在差异，与药材的不同产地来源具有一定相关性，例如，聚合为一类的S1 ～S5 中的黄芪产地均来自山西，聚合为一类的S9、S13、S14 中当归的产地均来自甘肃渭源，聚合为一类的S7、S11、S12 中的枸杞子产地均来自宁夏，药材来源产地不同对样品质量差异的控制产生一定影响。

图3 15 批芪苓益肾颗粒聚类分析图Fig 3 Cluster analysis of 15 batches of Qiling Yishen granules

2.4.6 主成分分析（PCA） 采用SPSS 21 和SIMCA 14.1 软件对15 批样品共有峰峰面积标准化和处理，进行主成分分析[18]。以特征值＞1 为提取标准，共提取出5 个主成分，分别是峰10（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊异黄酮）、峰1、峰20（芒柄花素），得到主成分的累积方差贡献率92.6%，能概括样品数据的绝大部分信息，故选取5 个主成分进行评价，在5 个主成分中特征值较大的是主成分1，其累积方差贡献率达74.285%。同时，图4 主成分分析结果可知PCA 将15 批芪苓益肾颗粒分为两类，S1 ～S6 聚合为一类，S7 ～S15 聚合为一类，与聚类分析结果一致。

图4 主成分分析得分图Fig 4 Principal component analysis score

2.4.7 正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）

采用SIMCA 14.1 软件，将15 批芪苓益肾颗粒样品的22 个共有峰峰面积标准化处理后的数据以监督模式化学识别方法OPLS-DA 进行建模分析，得分矩阵图、载荷散点图和变量重要投影值图[15，19]，见图5。结果显示，在置信区间（95%）内，15 批样品存在一定差异性。根据分布可将15 批样品分为两类，样品S1 ～S6 为一类，S7 ～S15 为一类。OPLS-DA 载荷散点图，每个点代表一个共有峰自变量，距离原点越远，对样品的区分越强。结合VIP 图可以为进一步确定对上述样品分类贡献较大的成分，以VIP 值＞1.0 为有意义变量，共提取出5 个特征峰，依次为峰10（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊异黄酮）、峰1、峰20（芒柄花素），说明这5 种成分可能是15 批芪苓益肾颗粒物质基准分类的差异性标志物。

图5 15 批芪苓益肾颗粒OPLS-DA 分析结果Fig 5 OPLS-DA analysis of 15 batches of Qiling Yishen granules

2.5 7 种指标成分含量测定

2.5.1 专属性试验 取“2.2.1”项下混合对照品溶液和供试品溶液（S11）适量，按“2.1”项下色谱条件分别进样，在毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、藁本内酯对照品相应位置上，供试品溶液均有相对应色谱峰出现，且色谱峰分离度与峰形均较好，结果见图2。

2.5.2 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液，用甲醇稀释成不同质量浓度的系列混合对照品溶液。按“2.1”项下条件进样，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），进行线性拟合，结果见表2。

表2 各化学成分的回归方程、相关系数和线性范围Tab 2 Regression equation，correlation coefficient and linearity

2.5.3 精密度试验 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，连续进样6 次，记录峰面积。结果7 种成分峰面积的RSD均在0.21%～0.72%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取供试品溶液（S11）适量，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果7 种成分峰面积RSD均在0.52%～1.9%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 取供试品溶液（S11）适量，室温下存放 0、6、12、24、48 h，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果7 种成分峰面积的RSD均在0.98%～2.2%，表明供试品溶液48 h 内稳定。

2.5.6 加样回收试验 取已知含量的样品（S11）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液9 份。精密量取“2.2.1”项下对照品储备液适量，配制与样品含量相同的混合对照品溶液，在上述供试品溶液中精密加入相当于样品体积50%、100%、150%的混合对照品溶液各3 份，混合均匀，按“2.1”项下色谱条件进样。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、藁本内酯低、中、高浓度平均回收率均在97.99% ～102.33%，RSD均＜2.0%，表明方法准确度良好。

2.5.7 样品含量测定 取15 批芪苓益肾颗粒供试品液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果见表3。15 批芪苓益肾颗粒样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、藁本内酯的质量分数范围分别为1.09 ～1.68、0.27 ～0.63、0.06 ～0.45、0.51～0.99、0.31～0.68、0.29～0.59、0.25～0.96 mg·g－1，结果表明批次间成分含量存在一定差异，例如黄芪产地为甘肃的毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量较高；当归产地为湖北的洋川芎内酯Ⅰ含量较低。其中15 批样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量分数最为突出，最高达到1.68 mg·g－1。

表3 芪苓益肾颗粒中7 种成分的含量Tab 3 7 components in the Qiling Yishen granules

3 讨论

3.1 提取方法的考察

制备完成15 批芪苓益肾颗粒样品细粉后，本试验分别考察了水、甲醇、80%甲醇及50%甲醇作溶剂制备供试品溶液，根据色谱峰的数量、峰形及化学成分溶出全面性等综合考虑，本文选择以50%甲醇为溶剂制备供试品溶液。

3.2 色谱方法考察

本研究前期考察了不同高效液相色谱仪（安捷伦1260 型、岛津LC-20AD）；不同厂家（Agilengt、YMC、Phenomenex、GL Sciences）色谱柱；不同流动相[甲醇-水、乙腈-水、乙腈-（0.1%磷酸-水）、乙腈-（0.05%磷酸-水）]；不同流速（0.8、1 mL·min－1）；不同柱温（30、35 ℃）；不同检测方式（分段波长法、波长全扫法）及不同检测波长（230、254、260、315 nm 等）等对色谱图的影响，最终确定以岛津LC-20AD高效液相色谱仪、GL Sciences ODS-3（5 μm，4.6 mm×250 mm，UP）色谱柱、（0.05%磷酸-水）（A）-乙腈（B）为流动相梯度洗脱、柱温35℃、流速1 mL·min－1，检测波长254 nm 为色谱方法。

3.3 含量测定指标成分选定

本研究经对照品与供试品及各阴性样品色谱图对照，共确认了18 个色谱峰的归属，其中7 种已知成分分别为黄芪中的毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素和当归中的阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、藁本内酯。在OPLS-DA试验中，以VIP 值＞1 为特征，选取5 个特征性成分，本试验选择差异较大且已知的4 种成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素同时进行含量测定。因上述4 种成分均归属于黄芪饮片，且依据本处方组方原理，结合文献资料当归中药理活性成分的综合研究[20-22]，发现当归中阿魏酸有抗血栓、抗炎、降血脂等作用，发挥活血祛瘀功效[23]；藁本内酯、洋川芎内酯Ⅰ有抗炎、镇痛及舒张血管等作用，可改善微循环，提高机体免疫调节，发挥“益气补血”功效[24-25]；三者药理作用与本方益气养血，健脾益肾功效相关性联系较紧密，本研究增加VIP 值靠前且已知的峰11（阿魏酸）、峰15（洋川芎内酯Ⅰ）、峰21（藁本内酯）的含量测定，以期为芪苓益肾颗粒物质基准质量标准提供参考。

3.4 结果分析

由于饮片的来源、产地不同，15 批芪苓益肾颗粒物质基准的含量存在一定差异，样品图谱中22 个共有峰的相似度均高于0.93。通过指纹图谱结合化学模式识别法，发现15 批芪苓益肾颗粒物质基准的质量存在显著差异，进一步利用CA、PCA 及OPLC-DA 法筛选出了对15 批样品差异产生贡献较大的5 个特征峰，分别是峰10（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）、峰17（芒柄花苷）、峰18（毛蕊异黄酮）、峰1 及峰20（芒柄花素）。

本研究建立了同时测定7 种有效成分的定量分析方法，包括4 种物质基准成分（毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素），对制订芪苓益肾颗粒物质基准的质量标准，全面控制该制剂物质基准质量具有指导意义。