呋塞米杂质B的潜在毒性预测研究

姜宏宇，王翰洵，王健*（. 沈阳药科大学制药工程学院，沈阳 006；2. 东北制药集团股份有限公司，沈阳 0027）

呋塞米（furosemide）， 化学名称为4-氯-2-[（2-呋喃甲基）氨基]-5-磺酰氨基苯甲酸，是一种强效速效类利尿药，通过抑制肾小管髓袢升支粗段对NaCl 的主动重吸收，排出大量接近于等渗的尿液[1]。呋塞米主要用于各种水肿，且能预防肾功能衰竭，对高血压也有一定治疗效果[2]。

呋塞米的制备过程中，以2，4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸为原料，在碱性条件下形成钠盐后，和糠胺于130℃反应生成呋塞米钠盐（见图1）。再经过乙醇精制后，酸化得到呋塞米。但是该工艺制备的呋塞米粗品会生成微量杂质2-氨基-5-氨磺酰基-4-氯苯甲酸（美国药典杂质B，欧洲药典杂质C，本文简称杂质B，见图2）。在原料糠胺的制备中，常用到甲醇的氨溶液，且氨分子在糠胺精制过程中因溶解度高，沸点低而难以被彻底除去，因此氨分子作为糠胺中的杂质被带入到呋塞米的合成中。在呋塞米的合成过程中，碱性条件下羧酸基团的氢离子被电离，产生负电中心，对糠胺和氨分子均具有位置限定作用，另外，磺酰胺基和羧基的钝化作用使得羧基的临位氯容易离去。这些因素导致杂质B 不可避免地出现在产物中。另一方面，呋塞米结构稳定性较差。在贮存、制剂生产过程中，呋塞米受到光照、加热及酸性等条件易被降解成产物B，因此呋塞米应在避光，阴凉处保存，同时对该降解杂质的检测方法也有大量报道[3-5]。相比于其他仅在生产和贮存过程中可能产生的杂质[如2，4-二氯-5-氨磺酰基苯甲酸、2-氯-4-（2-糠氨基）-5-氨磺酰基苯甲酸、2，4-双（2-糠氨基）-5-氨磺酰基苯甲酸等]，呋塞米在进入体内后，杂质B 也作为人类体内代谢产物出现[6-7]。该杂质在体内可能会与某些蛋白靶标发生结合，进而引发药品的不良反应[8]。

图1 呋塞米的工业合成路线Fig 1 Industrial synthetic route of furosemide

本文通过计算化学方法，预测该杂质的潜在毒性，为药物杂质研究提供新的视角。

1 仪器与试药

BT-25S 电子天平（赛多利斯）；Milli-Q Advantage 纯水仪（美国 Millipore 公司）；呋塞米、呋塞米相关物质B [纯度均为98%，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司]。

2 方法

2.1 杂质B 与呋塞米的结构相似性分析

杂质B 与呋塞米的结构分析通过Forge 软件进行，将两个化合物的结构转变为三维空间结构，并导入Forge 进行构象搜索和柔性叠合，根据力场特征进行相似性分析。

2.2 杂质B 的靶标预测

将杂质B 的结构，在RCSB PDB 数据库中进行结构相似性检索，选择蛋白-配体共结晶中配体与杂质B 具有最大相似性的蛋白靶标。根据数据库提供的以配体结构相似性排序方法，将检索结果排名由高到低排序，确定前三个蛋白为杂质B 最为可能的潜在蛋白靶标。

2.3 杂质B 与靶标作用方式分析

通过Glide 程序将杂质B 与预测的靶标进行分子对接，分析其作用方式。通过分子动力学程序Desmond，研究蛋白-化合物复合物在溶液状态下的动态过程。提取分子动力学轨迹文件，分析杂质B 在蛋白质活性位点的结合方式和亲和力。

2.4 杂质B 的ADME/Tox 性质预测

通过SWISSADME 在线程序（http：//www.swissadme.ch/）预测杂质B 的吸收、分配、代谢、排泄或毒性（ADME/Tox）性质。SWISSADME通过已有的毒性或药代动力学经验模型对给定的小分子进行计算，并给出模型预测的可能结果。

2.5 生物学实验

在37℃，将THLE-2 细胞在5%二氧化碳培养箱中孵育（Thermal Fisher Scientific）。培养基采用 DMEM（Biological Industries），并添加10%FBS（Biological Industries，Certified Foetal Bovine Serum）和1%青霉素-链霉素双抗（Biological Industries）。在96 孔板中加入不同浓度的杂质B，将对照细胞用赋形剂处理，孵育2 h。加入MTT 溶液（0.5 mg·mL－1）（Beyotime，ST1537）并孵育4 h 加入结晶紫溶液（Beyotime，C0121），使用酶标仪在492 nm 下测量吸光度。

3 结果

3.1 杂质B 与呋塞米的结构相似性比较

通过比较杂质B 与呋塞米的结构，可以发现二者在结构上具有很大的相似性，都具有电负性基团，而且两者在理化性质上也有较高的相似性，这揭示杂质B 与呋塞米可能会被同类型的蛋白靶点识别。相比于呋塞米，缺少了亲酯呋喃环的杂质B，分子量和SlogP值相对呋塞米均有显著的下降，但拓扑极性表面积（TPSA）未有明显改变。由两个分子的分子场叠合图可以看出两个分子除N-甲基呋喃侧链以外的特征极为相似（见图2）。

图2 杂质B 与呋塞米结构相似性比较Fig 2 Structural similarity between impurity B and furosemide

3.2 杂质B 的潜在靶点

在RCSB PDB 数据库中，根据杂质B 的结构式检索，发现有三个蛋白质可能会识别杂质B（见表1）。

表1 杂质B 潜在靶点Tab 1 Potential targets of impurity B

3.3 杂质B 与潜在靶点的作用方式分析

通过分子对接和分子动力学模拟研究，预测杂质B 与三个靶蛋白在生理条件下的动态结合方式，发现杂质B 与这三个靶点结合的可能性较高。其中，杂质B 与碳酸酐酶的锌离子形成配位键，与His64、Hid94、Glu106 和Thr199 形成氢键（见图3）；与甲状腺素结合球蛋白Asn278 和Arg301形成氢键（见图4）；杂质B 与巨噬细胞抑制因子Pro1，Met2 和Asp92 形成氢键（见图5）。由此推断，杂质B 可能会对以上三个蛋白具有调节活性。本研究发现其中一个靶点碳酸酐酶2 本身是呋塞米的作用靶点，因而推测杂质B 具有和呋塞米类似的利尿活性。此外，预测得到的靶点甲状腺素结合球蛋白，其生物学功能与甲状腺机能亢进相关，可以推测呋塞米杂质也可能具有类似不良反应。

图3 杂质B 与碳酸酐酶2（PDB 编号：1Z9Y）的结合方式Fig 3 Binding pattern of impurity B with carbonic anhydrase Ⅱ protein pocket（PDB code 1Z9Y）

图4 杂质B 与甲状腺素结合球蛋白（PDB 编号：2XN5）的结合方式Fig 4 Binding pattern of impurity B with thyroxine-binding globulin protein pocket（PDB code 2XN5）

图5 杂质B 与巨噬细胞抑制因子（PDB 编号：3RF4）的结合方式Fig 5 Binding pattern of impurity B with macrophage migration inhibitory factor protein pocket（PDB code 3RF4）

3.4 杂质B 与呋塞米的ADME/Tox 预测

通过Swiss ADME prediction 网站，预测杂质B 与呋塞米的ADME/Tox 的性质，结果发现杂质B 与呋塞米除不饱和以及极性两项偏离模型外其他性质良好。对比呋塞米，该杂质体现出相似的成药性特征，有较好的肠道透过性，且不易被P-gp 蛋白作为底物排出细胞，因此可以认定两者性质相似（见图6）。

图6 杂质B 与呋塞米的ADME/Tox 性质预测Fig 6 Prediction of ADME/Tox properties for impurity B and furosemide

3.5 杂质B 的细胞毒活性

药物杂质不仅可影响药物的纯度，超过限量的杂质可能导致毒副作用。由于呋塞米杂质B 的代谢途径尚未有相关报道，因此本工作假定该化合物通过肝脏代谢，并测试其对于人肝永生化细胞株THLE2 的毒性。检测杂质B 对人肝脏细胞THLE-2 存活率的影响，发现杂质B 仅能轻微降低人肝脏细胞THLE-2 的成活率，并具有浓度依赖性（见图7）。因此，推断杂质B 没有明显毒性。

图7 杂质B 对THLE-2 细胞的影响Fig 7 Effect of impurity B on THLE-2 cells

4 总结

综上所述，本文通过分子叠合及分子场模型，分子对接和药代动力学性质预测等计算化学方法，研究呋塞米杂质B 的潜在毒性。杂质B 与呋塞米结构相似但柔性更低且水溶性更好，可能与碳酸酐酶2、甲状腺素结合球蛋白和巨噬细胞抑制因子结合并具有与呋塞米相同的利尿活性。仅从计算模型预测结果来看，杂质B 毒性可能较小，易于透过肠道吸收且具有与呋塞米相似的成药性，有待相关药理实验进一步证明。同时，通过体外实验，验证杂质B 对于THLE-2 细胞没有明显影响。对该结果的进一步验证可以通过对杂质B 与碳酸酐酶2、甲状腺素结合球蛋白以及巨噬细胞抑制因子的表面等离子共振等实验确定其与上述蛋白的结合能力。进一步的生物学验证可通过对健康小鼠以杂质B 灌胃，测定离体甲状腺质量以及体质量的变化验证其毒性。预测方法的推广，对于新药研发中避免因候选药物毒性导致失败具有重要意义。