注射用曲札茋苷类过敏反应检测体系的应用

杨炳治，杨旭娟，黄茜，曹亚茹，刘国光，刘一丹*（1. 丽江文化旅游学院，云南 丽江 674100；.昆药集团股份有限公司药物研究院，昆明 650100）

中药注射剂是我国特有的中药剂型，已有几十年的发展历史。随着科技进步，中药注射剂作为现代中药剂型的发展方向之一，已广泛应用于危重疾病急救及感染性疾病、心脑血管疾病和恶性肿瘤等的治疗，在保障人类健康中发挥着重要作用[1]。然而，中药注射剂通常是由多种药材组成的复方，每味中药成分复杂多样，部分中药药效物质基础还未明确。此外中药材的质量受产地、采收季节影响较大，因产地、生长环境、采摘时间、存放时间长短不同等，导致同种药材的有效或有毒成分含量不同[2]，容易出现安全隐患。刘爽等[3]报道的文献中，整理了2010—2015年各年度国家药品不良反应监测通报的中药注射剂排名情况，可见排名始终位居前列的有清开灵注射液、参麦注射液、双黄连注射液。易艳等[4]报道的文献中，不良反应报道较多的3 种中药注射剂，分别为鱼腥草注射液、生脉注射液和清开灵注射液，结果显示临床1.5 倍和3.3 倍浓度的生脉注射液和清开灵注射液均可以引发小鼠发生以血管通透性增高为主要表现的轻微类过敏反应，并且呈现一定的量效关系。因此阳性对照物除了化合物Compound48/80（C48/80）还增加了清开灵注射液。

注射用曲札茋苷是从拉萨大黄药材乙醇提取物中分离、纯化得到，具有抗氧化、抗炎、抗神经细胞凋亡作用；能缩小缺血再灌注引起的脑梗死面积、减轻脑水肿，能改善脑卒中动物的行为学障碍、促进神经缺失症状的恢复。注射用曲札茋苷是昆药集团独创的一类创新药，目前已获得临床批件（No.2018L02062）。本文旨在建立RBL-2H3 细胞脱颗粒体外类过敏检测体系，对中药注射剂安全性进行快速初步评价，再结合小鼠体内类过敏检测体系进行综合分析，为企业中药注射剂类过敏反应做出及早预警和消除隐患提供一定技术手段，同时为企业注射剂再评价工作奠定基础。

1 材料

1.1 试药

注射用曲札茋苷（昆药集团药物研究院，批号：170101，规格：20 mg/瓶）；C48/80（Sigma 公司，批号：Lot#056M4067V，－20℃保存）；清开灵注射液（吉林省集安益盛药业股份有限公司，批号：17011604，规格：2 mL/支）。伊文思蓝（EB，上海源叶生物科技有限公司，批号：M26S6L3294）；甲酰胺（生工生物工程股份有限公司，批号：CB18BA0025）；MEM 培养基（HyClone 公司，批号：AC11016265）；胎牛血清（Gibco 公司，批号：1778586）；青-链霉素（BI 公司，批号：1731651）；PBS 缓冲液（Biosharp 公司，批号：67035331）；曲拉通X-100（TritonX-100，批号：20161121，规格：500 mL/瓶）；氯化钠注射液（浙江国镜药业有限公司，批号：A170525A1）；ELISA 试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：201801）；噻唑蓝（MTT，Aladdin 公司，批号：A1720090）；二甲基亚砜（DMSO，批号：BCBH5215V，Sigma 公司）。

1.2 细胞株和实验动物

大鼠嗜碱性白血病细胞株（RBL-2H3，广州吉妮欧生物科技有限公司）。SPF 级雄性ICR 小鼠，体质量18 ～22 g [昆药集团动物室，生产许可证：SCXK（滇）K2014-0001]。SPF 级雄性昆明种小鼠，体质量18 ～22 g [昆明医科大学实验动物中心，生产许可证：SCXK（滇）K2015-0002]。饲养于IVC 动物室，温度20 ～25℃，湿度40%～70%，12 h 明暗交替，适应性饲养2 d 进入实验。

1.3 仪器

PowerWaveXS2 全波长酶标仪（BioTek，Gene Company Limited）；XK96-A 快速混匀器（江苏新康医疗器械有限公司）；Milli-Q 超纯水机（Merch Millipore 德国）；SYNERGY HT 多功能酶标仪（BioTex 公司）；XD-202 倒置显微镜（南京江南永新光学有限公司）；CO2培养箱（Themo 公司）；STS-3脱色摇床（上海琪特分析仪器有限公司）；96 孔无菌细胞培养板（Gibco 公司）；各系列量程手动移液器及离心管、不同规格Tip 头（Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 体外检测方法建立

2.1.1 细胞活力的测定[5-6]将对数期的细胞配制成细胞悬液，按接种密度分为4 组：0.5×104、1×104、2×104、2.5×104个/孔，分别于0、6、12、24、36、48、60 h 取样检测细胞活力，分别于对应时间点前4 h 给予MTT 液，50 μL/孔，并补足培养液至200 μL，放入培养箱中继续培养4 h，小心弃去上清液，加入DMSO（200 μL/孔）震荡溶解5 min，于570 nm 处测定吸光度（OD）。

2.1.2β-氨基己糖苷酶释放率的测定 取对数期RBL-2H3 细胞，加入96 孔板随机分为阴性对照组（氯化钠注射液）、阳性对照组（C48/80 40 μg·mL－1或清开灵注射液1/32 原液、1/64 原液、1/128 原液）、注射用曲札茋苷组（200、100、50 μg·mL－1），每个浓度3 个复孔，每孔250 μL，培养1 h 后，取上清液，4℃、4000 r·min－1离心20 min，收集上清液；原细胞孔每孔加入250 μL 的0.1%TritonX-100，作用30 min，取上清液，4℃、4000 r·min－1离心20 min，收集上清液。在96 孔酶标板上，每孔加入β-氨基糖苷（7 mmol·L－1）50 μL，0.1%TritonX-100 5 μL， 各组上清液45 μL，37℃孵育90 min 后，每孔加入终止液NaCO3-NaHCO3150 μL，在405 nm 处使用酶标仪检测光吸收A值；β-氨基己糖苷酶释放率（%）＝[（各组上清样品酶活性光吸收A值－调零孔光吸收A值）/（各组上清样品酶活性光吸收A值＋各组细胞裂解孔光吸收A值－调零孔光吸收A值）]×100%。

2.1.3 组胺释放率的测定 按ELISA 试剂盒说明，利用酶标仪分别测定待测的细胞上清和裂解后细胞上清的光吸收A值，计算药物作用后细胞组胺释放率。组胺释放率（%）＝各组组胺上清释放量/（各组组胺上清释放量＋各组细胞裂解组组胺量）×100%。

2.2 注射用曲札茋苷体内检测类过敏反应

2.2.1 小鼠体内检测体系的建立[7]取60 只雄性ICR 小鼠，随机分为阴性对照组（氯化钠注射液）、阳性对照组[C48/80 1.25 mg·mL－1或相当于临床剂量20 倍和10 倍的清开灵高、低剂量组（0.7、0.35 mL）]、相当于临床剂量50 倍和30倍数的注射用曲札茋苷高、低剂量组（1.75、1.05 mg·mL－1）受试组，每组10 只。将含有0.8%伊文思蓝（EB）指示剂与各给药组按体积比1∶1进行配制，以20 mL·kg－1静脉注射（iv）给药。30 min 后，摘眼球取血，并分别用肝素抗凝管和普通离心管收集血液各约1 mL，放置2 h 后，3000 r·min－1离心5 min，收集上清液待测。脱颈椎处死小鼠，沿小鼠耳廓剪下耳朵，并记录小鼠耳朵反应率[反应率（%）＝出现耳廓蓝染的动物数/组内动物数×100%]，剪碎小鼠耳朵，放入5 mL 的离心管中，加入2 mL/管甲酰胺浸泡48 h[8-9]。昆明种小鼠模型建立与ICR 小鼠相同。

2.2.2 伊文思蓝渗出量及其升高率的计算 小鼠耳朵浸泡48 h 后，4000 r·min－1离心20 min，取上清液，加入96 孔酶标板中，每孔200 μL，酶标仪610 nm 处测定光吸收A值，并计算EB 渗出量（μg），EB 渗出升高率（%）＝（测试组EB 含量－对照组EB 含量）/对照组EB 含量×100%。

2.2.3 ELISA 法检测动物血液中组胺、IgE 及VEGF 含量 离心所收集的血液、血浆和血清按ELISA 试剂盒说明分别测定组胺、血管内皮生长因子（VEGF）与免疫球蛋白（IgE），计算含量。

2.2.4 统计学方法 运用IBM SPSS 23.0 统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较，采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD 方法比较，P≤0.05 时差异有统计学意义。

3 结果

3.1 体外实验结果

3.1.1 RBL-2H3 细胞生长曲线 由于对数期细胞代谢最活跃，对外界刺激敏感性最强，是进行药物影响实验的最佳对象。根据图1 的细胞生长曲线，可知接种密度为0.5×104个/孔在所选时间段内一直处于对数生长期，因此细胞最佳种植密度为：0.5×104个/孔、作用时间为24 h。

图1 RBL-2H3 细胞生长曲线Fig 1 RBL-2H3 cell growth curve

3.1.2β-氨基己糖苷酶和组胺释放率 从表1 可以看出，与阴性对照组相比，C48/80、清开灵注射液1/32 原液组、1/64 原液组β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率显著升高（P＜0.01）；注射用曲札茋苷各剂量组差异均无统计学意义。

表1 细胞上清β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率 ( ±s，n ＝3)Tab 1 Release rate and histamine release rate of cell supernatant β-aminoglycosidase ( ±s，n ＝3)

表1 细胞上清β-氨基己糖苷酶释放率和组胺释放率 ( ±s，n ＝3)Tab 1 Release rate and histamine release rate of cell supernatant β-aminoglycosidase ( ±s，n ＝3)

注：与阴性对照组相比，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，**P ≤0.01.

组别体系终浓度β-氨基己糖苷酶释放率/%组胺释放率/%阴性对照组－ 6.30±2.8358.80±2.78 C48/8040 μg·mL－119.16±1.50**70.84±5.64**清开灵注射液1/32 原液29.32±1.60**77.66±7.48**1/64 原液15.35±2.15**70.03±2.26**1/128 原液 8.81±1.0864.37±4.69注射用曲札茋苷 200 μg·mL－110.32±1.9263.89±3.50 100 μg·mL－1 9.99±1.5553.69±2.65 50 μg·mL－110.56±2.3349.36±7.34

3.2 体内实验结果

3.2.1 ICR 小鼠血管通透性情况 从表2 可以看出，与阴性对照组相比，C48/80 与相当于临床剂量倍数20 倍和10 倍的清开灵高、低剂量组中EB 渗出量升高（P＜0.01）；相当于临床剂量30倍和50 倍的注射用曲札茋苷组差异无统计学意义；其中C48/80、清开灵注射液高、低剂量EB升高率≥150%，类过敏较严重[10-11]。

表2 受试物诱导ICR 小鼠耳廓血管通透性增高反应(n ＝10)Tab 2 Increased auricle vascular permeability induced by test substance in ICR mice (n ＝10)

3.2.2 ELISA 试剂盒检测ICR 小鼠相关因子 从表3 可以看出，与阴性对照组相比，C48/80、清开灵注射液高、低剂量组的VEGF 和组胺明显升高（P＜0.01）；清开灵高、低剂量组的IgE 明显降低（P＜0.01）；注射用曲札茋苷高、低剂量组IgE、VEGF、组胺差异均无统计学意义。

表3 ELISA 试剂盒测ICR 小鼠相关因子( ±s，n ＝10)Tab 3 Detection of related factors in ICR mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

表3 ELISA 试剂盒测ICR 小鼠相关因子( ±s，n ＝10)Tab 3 Detection of related factors in ICR mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

注：与阴性对照组相比，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，**P ≤0.01．

组别浓度IgE/（ng·mL－1）VEGF/（ng·mL－1）组胺/（ng·mL－1）阴性对照组（0.4%EB）－71.02±5.41 5.59±2.140.15±0.12 C48/801.25 mg·mL－161.67±12.5713.07±2.71**0.53±0.16**清开灵注射液0.7 mL50.96±6.07**11.05±2.07**0.55±0.14**0.35 mL48.55±16.64** 9.98±1.34**0.44±0.16**注射用曲札茋苷组1.75 mg·mL－159.78±12.04 6.25±1.070.25±0.09 1.05 mg·mL－157.23±14.64 7.62±0.580.24±0.09

3.2.3 ICR 小鼠耳朵蓝染情况 ICR 小鼠耳朵蓝染情况见图2，C48/80 组反应率为100%；清开灵高、低剂量组反应率为80%。注射用曲札茋苷高剂量耳蓝染动物数为3，反应率为30%，低剂量耳蓝染动物数为2，反应率为20%。

图2 ICR 小鼠耳朵蓝染情况Fig 2 ICR mice the conditions of auricle blue staining

3.2.4 昆明种小鼠血管通透性情况 表4结果显示，与阴性对照组相比，C48/80 组与相当于临床剂量倍数20 倍和10 倍的清开灵高、低剂量组EB 渗出量升高（P＜0.01）；相当于临床剂量倍数50 倍和30倍的注射用曲札茋苷组差异无统计学意义。

表4 受试物诱导昆明种小鼠耳廓血管通透性增高反应(n ＝10)Tab 4 Increased auricle vascular permeability induced by test substance in Kunming mice (n ＝10)

3.2.5 ELISA 试剂盒检测昆明种小鼠相关因子从表5 可以看出，与阴性对照组相比，清开灵高、低剂量组和注射用曲札茋苷高、低剂量组IgE 降低（P＜0.01）；C48/80 组、清开灵高、低剂量组组胺含量升高（P＜0.01）；C48/80 组、清开灵高、低剂量组VEGF 升高（P＜0.01，P＜0.05）；注射用曲札茋苷组高、低剂量组VEGF、组胺差异无统计学意义。

表5 ELISA 试剂盒测昆明种小鼠相关因子( ±s，n ＝10)Tab 5 Detection of related factors in Kunming mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

表5 ELISA 试剂盒测昆明种小鼠相关因子( ±s，n ＝10)Tab 5 Detection of related factors in Kunming mice by ELISA ( ±s，n ＝10)

注：与阴性对照组相比，*P ≤0.05，**P ≤0.01。Note：Compared with the negative control group，*P ≤0.05，** P ≤0.01.

组别浓度IgE/（ng·mL－1）VEGF/（ng·mL－1）组胺/（ng·mL－1）阴性对照组（0.4%EB）－62.35±7.44 6.46±2.290.35±0.23 C48/801.25 mg·mL－152.50±10.2711.74±1.6**0.61±0.12**清开灵注射液0.7 mL41.88±18.92**10.22±1.5**0.63±0.13**0.35 mL39.29±10.35** 9.48±1.65*0.61±0.12**注射用曲札茋苷组1.75 mg·mL－141.45±7.59** 7.95±1.840.35±0.16 1.05 mg·mL－142.23±14.93** 5.59±2.070.25±0.09

3.2.6 昆明种小鼠耳朵蓝染情况 昆明种小鼠耳朵蓝染情况见图3，C48/80 组反应率为100%，清开灵高剂量组反应率为100%，清开灵低剂量组反应率为90%；注射用曲札茋苷高、低剂量组反应率为0。

图3 昆明种小鼠耳朵蓝染情况Fig 3 Auricle blue staining in Kunming mice

4 讨论

国家食品药品监督管理局要求注射用曲札茋苷申报临床批件时要有更灵敏的过敏反应检测方法，而目前国际上缺乏对类过敏检测的统一方法，公认的有非免疫介导IgE、类过敏所致靶细胞脱颗粒机制、激活补体系统机制、激活激肽释放酶-激肽系统途径、急性过敏途径以及细胞骨架重排；体内模型的建立主要依据的是非免疫介导IgE 机制与释放炎症介质导致血管通透性增加；释放炎症介质导致血管通透性增加从而引发类过敏反应的概念已比较成熟。与此同时非免疫介导IgE 机制还需进一步验证，力争有更为详实的数据支持。

本研究通过试剂盒检测 ICR 小鼠和昆明种小鼠的相关因子，发现C48/80 组的IgE 与阴性对照组相比没有明显差异；但在ICR 小鼠中，清开灵高、低剂量组IgE 与阴性对照组差异具有统计学意义；在昆明种小鼠中，清开灵和注射用曲札茋苷高、低剂量组IgE 与阴性对照组差异具有统计学意义；所有组别的IgE 与阴性对照组相比，都具有明显的下降趋势。为了进一步明确类过敏反应的作用趋势，后期需要更多的数据进行验证。

RBL-2H3 细胞质内含有丰富的嗜碱性颗粒，当细胞发生类过敏反应时，会释放组胺、β-氨基己糖苷酶等各类细胞因子[12-13]。其中组胺是经典的过敏介质，但检测结果的稳定和重复性较差，需要在短时间内迅速完成实验测定[14]。VEGF 亦被称为血管通透因子，是一种分泌型多肽和强力内皮细胞分裂剂。VEGF 能够与血管内皮细胞表面受体结合，产生一系列细胞信号级联反应，从而导致微血管内皮通透性增高[15-16]。C48/80 能够激活G 蛋白，进而激活蛋白激酶C 和Ca2＋通道，使内质网释放Ca2＋进入细胞内，肥大细胞和嗜碱性粒细胞内的颗粒囊泡移向胞浆膜并释放生物介质，从而引发类过敏反应[17-18]。EB 是一种无明显毒性的蓝色染料，可迅速与血浆蛋白（主要为白蛋白）结合，形成蛋白结合物[19-20]。当血管通透性升高时，其可随着血浆蛋白渗出到血管外的组织间隙中，造成组织明显蓝染，以反应率、EB渗出升高率为指标，定量定性分析样品在小鼠体内类过敏的反应程度[21]。

综上所述，EB 渗出量与药物剂量成正相关趋势，且ICR 小鼠较为敏感，本研究通过对注射用曲札茋苷的初步评价可得其在该体内外体系中不存在类过敏反应，安全性较高，这也对其用法用量提供一定的指导意义。