伏九贴敷药物通过调控RORγt、Foxp3 mRNA表达重塑Th17/Treg免疫平衡的抗哮喘机制初探

付昆，杨艳，陆一菱，仲蓬，何春杨，徐敏（成都市第三人民医院，西南交通大学附属医院，重庆医科大学附属成都第二临床学院，成都 610031）

伏九贴敷是本院开展的特色中医外治疗法，由白芥子、甘遂、延胡索、细辛组成，通过药物透皮作用和穴位刺激共同作用防治哮喘等呼吸系统疾病。因该疗法选用带有刺激性的药物，引起局部充血、发泡促进药物的吸收，故而对皮肤刺激性较大。组方中白芥子药物为皮肤刺激性的源头，生白芥子刺激性强于炒白芥子。本课题组前期就此疗法皮肤刺激性与抗哮喘作用相关性进行了研究[1]，发现伏九贴敷药物中生白芥子和炒白芥子的比例各半时，既可维持疗效，又能减轻其对皮肤的副作用。故本研究以该生、炒白芥子配比处方剂量探讨伏九贴敷药物的抗哮喘作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

雄性SPF 级SD 大鼠，体质量180 ～220 g[成都达硕实验动物有限公司，动物生产许可证：SCXK（川）2019-189]。于18 ～25℃，12 h 明暗周期交替，适应性饲养5 d，自由饮水、进食。

1.2 试药

醋延胡索、醋甘遂、生芥子、炒芥子、细辛均购自四川省中药饮片有限公司，批号分别为200318、190524、200506、191203、200420，由成都市食品药品检验研究院文永盛主任药师鉴定为正品。按芥子∶延胡索∶甘遂∶细辛＝2（生、炒各半）∶1∶1∶1 比例将各药物粉碎为100 目细粉混合，以生姜汁调成糊状制成伏九贴敷药物备用。

卵蛋白（OVA，货号：A5253，Sigma 公司），Al（OH）3（批号：20161130，国药集团化学试剂有限公司），地塞米松磷酸钠注射液（批号：2001202，国药集团容生制药有限公司），三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇（批号分别为10006818、80109218、10009218，国药集团化学试剂有限公司），苏木素、PAS 试剂盒（武汉谷歌生物），Trizol（Invitrogen），HyPure Molecular Biology Grade Water（HyClone），5×All-In-One RT Master Mix、EvaGreen Express 2×qPCR Master Mix-No Dye（abcam）。

1.3 仪器

PL-203 电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，NE-C801 压缩式雾化器[欧姆龙（大连）有限公司]，JJ-12J 脱水机、JB-P5 包埋机（武汉俊杰电子有限公司），RM2016 切片机（上海徕卡仪器有限公司），KZ-II 匀浆仪（赛维尔生物），D3024R 高速冷冻型微型离心机（SCILOGEX），SLAN-96S PCR analysis system（上海宏石医疗科技有限公司），K2800 核酸分析仪（北京凯奥科技发展有限公司），Eclipse E100光学显微镜（Nikon）。

2 方法

2.1 模型建立

实验第1日、7日于大鼠腹腔注射1 mL 含有OVA（100 mg）、氢氧化铝（100 mg）的混合液致敏。第15日开始，每日给予大鼠1% OVA 雾化吸入，激发哮喘，每日1 次，每次20 min，连续7 d。密切观察大鼠激发后的反应情况：有无呼吸急促、喘息、发绀等症状，行动有无改变。以大鼠出现烦躁呛咳、呼吸加快、幅度加大、点头呼吸运动、腹肌痉挛、频繁挠鼻及站立不稳、竖毛等典型哮喘样发作症状为激发成功。

2.2 分组与给药

将30 只SD 大鼠按体质量随机分为5 组：正常组、模型组、假贴敷组、伏九贴敷药物组和地塞米松组。除正常组外，其余各组大鼠按“2.1”项下方法造模。正常组大鼠同法于第1日、7日腹腔注射生理盐水1 mL，第15日开始以生理盐水同法雾化吸入，连续7 d。末次雾化后，正常组和模型组不做任何处理。伏九贴敷药物组大鼠用8% Na2S 进行脱毛，第2日取调制好的伏九贴敷药物适量，按照《实验针灸学》取穴方法[2]敷于大椎、肺腧（双侧）、肾腧（双侧）穴并用胶布固定，每次贴敷4 h，隔日贴敷1 次，共给药7 次。假贴敷组同样贴上无药空白胶布。地塞米松组腹腔注射地塞米松0.5 mg·kg－1，隔日1 次，共给药7 次。

2.3 肺组织气道病理考察

末次给药24 h 后处死大鼠，取右肺组织固定24 h。石蜡包埋、3 μm 切片；脱蜡，依次高碘酸→Schiff 试剂→苏木素染色；中性树胶封片，显微镜观察PAS 染色结果，并根据支气管周围PAS 染色阳性细胞密集程度进行病理评分，0 分：无或偶见；1 分：稀疏、散在；2 分：较密集；3 分：大量。

2.4 肺组织辅助性T 细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg）细胞因子及转录因子基因表达的检测

取肺组织100 mg 置于无RNA 酶的离心管中匀浆，12 000 r·min－1离心10 min，取上清液，Trizol 抽提总RNA，核酸分析仪检测RNA 浓度及纯度。采用5×All-In-One RT Master Mix 反转录RNA，配制20 μL 反应体系以转录的cDNA 为模板进行PCR 扩增。反应体系：2×qPCR Mix 10 μL，7.5 μmol·L－1primer 1.2 μL，Template 2.0 μL，ddH2O 6.8 μL。反应条件：95℃预变性10 min；95℃ 变性15 s，60℃ 退火60 s，40 个循环。60℃→95℃，每15 s 升温0.3℃进行熔解曲线分析。以β-actin为内参基因，检测目标基因和β-actinCt值，采用2－△△Ct法（△Ct＝Ct目标基因－Ctβ-actin）计算mRNA的相对表达量。各mRNA 引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 检测各基因引物信息Tab 1 Primers of various genes for qRT-PCR determination

2.5 统计方法

正态分布的定量资料以±s表示，进行单因素方差分析检验，若方差齐采用LSD 法进行多重比较，方差不齐则用Dunnett’s T3检验；非正态分布资料采用非参数秩和检验，数据则以中位数（四分位间距）表示。采用Pearson 积差法进行相关分析。以SPSS 23.0 软件进行统计分析，P＜0.05 认为组间差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 伏九贴敷药物对哮喘大鼠肺组织气道炎症病理变化的影响

杯状细胞及黏液细胞数量可以反映气道黏液分泌情况[3]。肺组织样本经PAS 染色后，镜检可见支气管上皮细胞中PAS 阳性细胞数量的改变明显。正常组大鼠支气管上皮细胞中几乎未查见PAS 阳性细胞，在模型组和假贴敷组大鼠中容易见到支气管上皮较多的PAS 阳性细胞，伏九贴敷药物组和地塞米松组PAS 阳性细胞则相对稀疏，如图1 所示。通过半定量评分显示，模型组气道上皮PAS染色阳性细胞密集程度计分为1.5（1，2.25）[数据以中位数（四分位间距）表示，下同]明显高于正常组0（0，0），表明哮喘大鼠气道黏液分泌增多，炎症反应重；而假贴敷组评分为1（1，3）和模型组比较无明显差异，说明空白胶布贴敷对哮喘并没有治疗作用。伏九贴敷和地塞米松组阳性细胞密集程度评分均为0（0，0.25），明显低于模型组。

图1 伏九贴敷药物对哮喘大鼠肺组织气道PAS 阳性细胞病理改变的影响（Bar ＝100 μm）Fig 1 Effect of Fujiu patching medicine on the pathological alterations of PAS positive cells in the lung airway epithelium of asthmatic rat models（Bar ＝100 μm）

3.2 伏九贴敷药物对哮喘大鼠Th17、Treg 细胞因子及特异性转录因子表达的影响

从图2 可以看出，与正常组比较，模型组肺中TNF-α、IL-1β、IL-17、RORγt mRNA 相对表达量升高（P＜0.01 或P＜0.05），IL-10 和Foxp3 mRNA的表达降低（P＜0.01），IL-17/IL-10 和RORγt/Foxp3表达升高（P＜0.01）。与模型组比较，假贴敷组的Foxp3 mRNA 表达降低（P＜0.01），其余各基因的mRNA 表达水平无差异。与模型组比，给予伏九贴敷药物后，TNF-α、IL-1β、IL-17、RORγt mRNA 的表达水平下调，而IL-10 和Foxp3 mRNA 的表达量增加，IL-17/IL-10 和RORγt/Foxp3 比值降低（P＜0.01或0.05），阳性药地塞米松对上述mRNA 显示出同样的调控效果。

图2 伏九贴敷药物对各组大鼠肺中基因mRNA 相对表达量的影响（*P ＜0.05，**P ＜0.01）Fig 2 Effect of Fujiu patching medicine on the relative mRNA expressions of various genes in the lung of different rats（*P ＜0.05，**P ＜0.01）

3.3 相关性分析

Pearson 相关分析显示，哮喘大鼠肺IL-17 和RORγt 的表达水平与炎性介质TNF-α、IL-1β表达成正相关（P＜0.01）；IL-17/IL-10 和RORγt/Foxp3 表达量比值与TNF-α、IL-1β表达水平成正相关（P＜0.001）；而IL-10 和Foxp3 表达水平则与TNF-α、IL-1β表达成显著负相关（P＜0.001）。分析结果见图3。

图3 大鼠肺组织各mRNA 表达相关性分析结果Fig 3 Correlation among various mRNA expressions in the lung tissue of rat

4 讨论

哮喘是多种细胞和细胞成分参与的慢性气道炎症性疾病，可引起炎症、黏液分泌过多、血管再生和气道重塑[4]。免疫功能异常被认为是哮喘发生发展的病机，其中Th 起着至关重要的作用[5]。Th17 细胞能释放IL-17，并间接招募中性粒细胞和聚集嗜酸性粒细胞，进一步加重哮喘发作[6-7]。而表达叉头盒蛋白3（Foxp3）转录因子的CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 细胞具有维持自身耐受的功能[8]，它通过IL-10、TGF-β等细胞因子发挥作用，主要参与免疫应答和其他免疫细胞功能的调节，进而将与T 细胞有关的免疫应答控制在适当的范围内，避免对机体的损害[9]。不少证据表明，哮喘是通过Treg 细胞及其细胞因子来抑制的，而Th17 细胞及其细胞因子则会加重哮喘的症状，揭示了这些细胞的活性与哮喘的病理和治疗效果有关[10]。因此，Th17/Treg 及其相关细胞因子IL-17/IL-10 的失衡也是哮喘发病机制的重要病理生理基础[11]，恢复Th17/Treg 免疫平衡是治疗哮喘的关键，目前已成为研究领域的热点。Th17 细胞的分化受维A 酸相关孤儿受体γt（RORγt）的特异性调控，CD4＋T 细胞向Th17 细胞的分化往往伴随着家族特异性转录因子RORγt 和标志性细胞因子IL-17 的表达[12-13]。另一方面，Foxp3 是Treg 细胞不可缺少的主要转录因子，它的稳定表达对Treg 细胞的发育和功能至关重要，Foxp3 缺乏会导致CD4＋T 细胞向Treg 细胞分化不足[14]。Foxp3 可通过与RORγt 的直接相互作用抑制Th17细胞的分化[15]。因此RORγt 与Treg 细胞的Foxp3在功能上相互制约，成为维持Th17/Treg 细胞平衡的关键[16]。

哮喘的本质是变态反应性疾病。当过敏原进入体内时，T 细胞和B 细胞分化为浆细胞，产生IgE 抗体，激活肥大细胞。肥大细胞脱颗粒，分泌IL-1β、TNF-α、MIP-1α、IL-13 等细胞因子和各种趋化因子，这些细胞因子共同作用引起白细胞浸润和持续炎症[17-18]。哮喘的慢性气道炎症组织学特征可表现为支气管黏膜杯状细胞增生，黏液分泌过多等。PAS 阳性细胞多少可间接反映气道炎症的杯状细胞增生和黏液分泌情况[3]。本实验通过OVA/Al（OH）3联合造模发现，哮喘大鼠肺组织气道黏膜上皮PAS 阳性细胞密集，存在大量杯状细胞增生和黏液分泌，病理改变评分显著高于正常组，气道炎症反应严重。此外，模型组Th17 相关细胞因子IL-17、特异转录因子RORγt mRNA 表达水平升高，说明Th17 细胞分化优势明显；而IL-10、Foxp3 mRNA 表达出现下降，提示Treg 细胞发育和功能受阻，使得IL-17/IL-10 和RORγt/Foxp3 比值上升，哮喘大鼠体内出现了向Th17 优势分化的Th17/Treg 失衡。机体免疫平衡被打破，继而出现变态反应，大量炎性细胞因子释放，TNF-α、IL-1βmRNA表达增加，最终引起哮喘大鼠的气道炎症反应。从相关性分析结果也可以看出，Th17 相关的IL-17 和RORγt 的表达水平与炎性介质TNF-α、IL-1β表达正相关，而Treg 相关的IL-10 和Foxp3 表达水平与之负相关。提示Th17 可能为促炎因素，而Treg 可能抑制炎症因子表达。同时IL-17/IL-10、RORγt/Foxp3 比值也和炎性因子TNF-α、IL-1β表达正相关，说明如果IL-17 和RORγt 表达下调的同时IL-10、Foxp3 表达增加可使IL-17/IL-10 及RORγt/Foxp3 比值降低，炎性因子TNF-α、IL-1β表达会随之减少。IL-17/IL-10、RORγt/Foxp3 比值的下降预示着Th17/Treg 平衡在重新恢复，机体免疫功能增强，哮喘炎症反应可随之改善。

本院开展的伏九贴敷是以清代医家张璐发明的中药白芥子外涂法为基础，由白芥子、延胡索、细辛、甘遂组成，临床外治哮喘疗效确切，为其药物作用机制研究提供了可靠依据。方中作为君药的白芥子的主要成分有白芥子苷、芥子酶、芥子碱等。白芥子苷经过芥子酶的作用，可水解生成硫代异氰酸对羟苄酯，该成分能使皮肤发红甚至发泡，从而破坏皮肤屏障功能，促药渗透。此外，白芥子醇提物对炎症早期的水肿和渗出有明显的抑制作用[19]。延胡索在方中与白芥子皆为主药，其主要成分为延胡索乙素，具有很强的镇痛、镇静等作用，本方取其行气活血止痛之功效，可以起到加强或促进其他药物吸收、减轻皮肤刺激、缓解疼痛的效果。细辛中的α-细辛脑可松弛支气管平滑肌，减轻黏膜充血和水肿，缓解下呼吸道阻塞。L-细辛脂素可能通过抑制T 细胞的增殖与活化，抑制气道嗜酸性粒细胞炎症反应来抑制速发型哮喘反应[20]。生甘遂醇提取物具有强烈刺激性，方中应用可能为取其对皮肤的刺激性，助力其他药物有效成分通过皮肤渗透到气管、肺等组织中发挥作用。纵观全方，四味药多组分协同作用，共奏抗炎平喘之效。本文试图从分子水平以Th17/Treg 平衡为切入点进一步揭示伏九贴敷药物防治哮喘的机制。结果显示，伏九贴敷药物可以明显减少哮喘模型大鼠的气道上皮杯状细胞增生和黏液分泌，有效缓解哮喘的气道炎症反应。并且可以下调IL-17、RORγt mRNA 表达水平，同时上调IL-10、Foxp3mRNA 的表达，使IL-17/IL-10、RORγt/Foxp3 比值重新趋于平衡，重塑Th17/Treg免疫平衡，从而减少炎症介质TNF-α、IL-1β的表达量，最终减轻肺组织气道炎症，发挥抗哮喘作用。由此可见，对Th17/Treg 失衡的影响可能是伏九贴敷药物治疗哮喘的作用机制之一。

伏九贴敷通过穴位贴敷使腧穴局部皮肤充血，促进药物的吸收；继而发挥全身作用，使免疫系统发生相应的改变，以达到抗炎、平喘及提高机体免疫力的目的。从临床报道看，伏九贴敷能有效缓解哮喘症状，减少发作次数，增强患者的抵抗力，远期疗效较好，不良反应少，尤其是在治疗哮喘缓解期及协助西药巩固发作期疗效、降低西药不良反应方面具有特殊优势[21]，具备积极推广运用的价值。为此，本文从Th17/Treg 平衡角度浅析了伏九贴敷药物影响机体免疫系统的抗哮喘作用机制，为该疗法临床应用提供了一定的理论支持，但更深入的作用机制以及透皮吸收的量效关系还有待进一步研究。