藤石松乙酸乙酯部位的化学成分研究

姚晓长，蒋梅香，刘阳，邹振兴，谭桂山，，李静*（. 中南大学湘雅医院药学部，长沙 40008；2. 湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 4202；. 中南大学湘雅药学院，长沙 400）

石松科（Lycopodiaceae）植物为蕨类植物门石松纲石松目植物，可分为3 个亚科，共16 属，全世界范围内分布大约有388 种，为温带和亚热带气候特有植物，大量存在于针叶林、山区和沼泽地[1]。在我国共有6 属14 种，分别为石松属、拟小石松属、小石松属、垂穗石松属、扁枝石松属和藤石松属[2]。藤石松[Lycopodiastrum casuarinoides（Spring）Holub]为藤石松属的单种属植物，主要分布于我国江西、湖南、四川、广西、云南等地，用于风湿骨痛、关节炎、跌打损伤等疾病的治疗[2]。既往文献分析表明，藤石松中富含与阿尔茨海默病治疗药物石杉碱甲相同类型的石松生物碱[3-7]，其生物活性研究亦多以胆碱酯酶抑制活性[4-5]为主，偶见少量抗肿瘤[6-7]、抗炎[8-9]等研究。

目前，藤石松中其他类型的化学成分报道较少，本课题组从中分离得到除石松生物碱类外的萜类、色原酮类和脂肪族类等化合物，且药理实验表明石松生物碱类、萜类和脂肪族类化合物均具有胆碱酯酶抑制活性[5，10-11]，这说明藤石松的胆碱酯酶抑制活性可能与植物中的多种化学成分相关联。

为进一步研究藤石松化学成分的多样性与生物活性的关联，对藤石松的化学成分进行系统研究，从75%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分中分离得到10 个非生物碱类化合物，且化合物1 ～10（结构式见图1）均为首次从藤石松属植物中分离得到。

图1 藤石松中化合物1 ～10 的结构Fig 1 Structures of compounds 1 ～10 from Lycopodiastrum casuarinoides

1 材料

硅胶（200 ～300 目，青岛海洋化工厂）；聚酰胺（80 ～100 目，国药集团化学试剂有限公司）；ODS 柱色谱（20 ～45 μm，日本Tokyo）；半制备型HPLC 色谱（美国Agilent 1260）；制备色谱柱（北京绿百草科技发展有限公司SilGreen C18色谱柱）；高分辨质谱仪（美国Agilent 6540 Q-TOF）；Avance-400、500 型核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）；乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷、甲醇均为分析纯（成都科龙化工试剂厂）；乙腈为色谱纯（美国Sigma 公司）。

藤石松全草采集于湖南省宜章县和花垣县，经厦门大学李振基教授鉴定为石松科藤石松属植物藤石松[Lycopodiastrum casuarinoides（Spring）Holub]的干燥全草。样本（No. 20160712）存放于中南大学湘雅药学院药物化学系。

2 提取与分离

藤石松干燥全草20 kg，用75%乙醇回流提取3 次，每次2 h，提取液浓缩成流浸膏1.8 kg。流浸膏加3%的酒石酸水溶液混悬至约20 L，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚萃取物（37 g）、乙酸乙酯萃取物（248 g）和正丁醇萃取物（1.2 kg）。

乙酸乙酯萃取物（248 g）经硅胶柱层析，用二氯甲烷-甲醇（100∶0 ～0∶100，V/V）梯度洗脱，薄层色谱检测合并后得到8 个组分（Fr.A ～H）。Fr. B（20.8 g）经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（150∶1 ～60∶1，V/V）梯度洗脱，薄层检测合并得到Fr. B1 ～B6。Fr. B1（4.1 g）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（30∶1 ～1∶5，V/V）梯度洗脱，得到化合物1（2.9 mg）。Fr.B2（5.7 g）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（15∶1 ～1∶5，V/V）梯度洗脱，薄层检测合并得到5 个组分Fr. B2-1 ～Fr. B2-5。Fr. B2-1 经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（2∶1 ～1∶5，V/V）梯度洗脱，再经ODS 柱色谱，以甲醇-水（70∶30 ～95∶5，V/V）梯度洗脱，得到化合物2（6.2 mg）。Fr. B2-2 经聚酰胺柱色谱，以甲醇-水（3∶7 ～9∶1，V/V）梯度洗脱，再经半制备HPLC，以乙腈-水（10∶90 ～85∶15，V/V，60 min）梯度洗脱，得到化合物3（8.5 mg）、4（9.2 mg）和5（12.2 mg）。Fr. B3（1.9 g）经ODS 柱色谱，以甲醇-水（3∶7 ～8∶2，V/V）梯度洗脱，再经半制备HPLC，以乙腈-水（5∶95 ～65∶35，V/V，60 min）梯度洗脱，得到化合物6（3.3 mg）、7（2.5 mg）和8（4.8 mg）。Fr. B4（2.6 g）经ODS 柱色谱，以甲醇-水（2∶8 ～8∶2，V/V）梯度洗脱后，再经半制备HPLC，以乙腈-水（5∶95 ～55∶45，V/V，60 min）梯度洗脱，得到化合物9（5.1 mg）和10（7.3 mg）（分离流程见图2）。

图2 藤石松乙酸乙酯萃取物的分离流程Fig 2 Isolation of ethyl acetate extract from Lycopodiastrum casuarinoides

3 结构鉴定

化合物1：无色油状液体，易溶于甲醇。HRESI-MSm/z：97.0286 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.07（1H，d，J＝3.6 Hz，H-3），6.53（1H，dd，J＝3.6，2.0 Hz，H-4），7.63（1H，d，J＝2.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：144.9（C-2），115.2（C-3），111.1（C-4），148.1（C-5），165.1（CHO）。以上数据与文献[12]基本一致，鉴定化合物1 为呋喃甲醛（furfural）。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇。HRESI-MSm/z：131.0344 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.76（1H，d，J＝15.8 Hz，H-2），6.83（1H，d，J＝15.8 Hz，H-3），3.80（3H，s，OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：166.3（C-1），131.7（C-2），135.4（C-3），165.8（C-4），51.2（C-1'）。以上数据与文献[13]基本一致，鉴定化合物2 为富马酸单甲酯（monomethyl fumarate）。

化合物3：浅黄色粉末，易溶于甲醇、氯仿。HR-ESI-MSm/z：211.0978 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：2.63（2H，t，J＝7.9 Hz，H-7），2.90（2H，t，J＝7.7 Hz，H-8），3.70（3H，s，9-OCH3），3.90（3H，s，3-OCH3），6.66（1H，dd，J＝8.0，2.0 Hz，H-6），6.69（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.85（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：132.5（C-1），110.9（C-2），146.4（C-3），144.0（C-4），114.3（C-5），120.8（C-6），30.7（C-7），36.1（C-8），173.4（C-9），51.6（3-OCH3），55.9（9-OCH3）。以上数据与文献[14]基本一致，鉴定化合物3 为二氢阿魏酸甲酯（dihydroferulic acid methyl ester）。

化合物4：浅黄色粉末，易溶于甲醇、氯仿。HR-ESI-MSm/z：225.1135 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：1.26（3H，t，J＝7.1 Hz，H-2'），2.61（2H，t，J＝7.9 Hz，H-7），2.90（2H，t，J＝7.7 Hz，H-8），3.90（3H，s，3-OCH3），4.15（2H，q，J＝7.1 Hz，H-1'），6.72（1H，dd，J＝8.4，1.6 Hz，H-6），6.73（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），6.85（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：132.5（C-1），110.9（C-2），146.4（C-3），144.0（C-4），114.3（C-5），120.9（C-6），30.7（C-7），36.4（C-8），173.0（C-9），55.9（3-OCH3），60.4（C-1'），14.2（C-2'）。以上数据与文献[15]基本一致，鉴定化合物4 为二氢阿魏酸乙酯（dihydroferulic acid ethyl ester）。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇、氯仿。HR-ESI-MSm/z：209.0814 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.55（1H，d，J＝15.7 Hz，H-7），7.06（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），6.93（1H，dd，J＝8.0、2.0 Hz，H-6），6.78（1H，d，J＝8.0 Hz，H-5），6.24（1H，d，J＝15.7 Hz，H-8），4.23（H，q，J＝7.0 Hz，H-1'），1.33（3H，t，J＝7.0 Hz，H-2'）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：126.2（C-1），113.6（C-2），145.4（C-3），144.0（C-4），115.1（C-5），121.5（C-6），145.4（C-7），115.1（C-8），168.0（C-9），60.0（C-1'），13.2（C-2'）。以上数据与文献[16]基本一致，鉴定化合物5 为咖啡酸乙酯（caffeic acid ethyl ester）。

化合物6：黄色针状晶体，易溶于二甲基亚砜。HR-ESI-MSm/z：193.0501 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：6.98（1H，s，H-3），6.21（1H，s，H-6），6.34（1H，s，H-8），1.95（3H，s，2-CH3）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：156.7（C-2），110.2（C-3），181.9（C-4），162.0（C-5），99.0（C-6），165.0（C-7），93.7（C-8），158.6（C-9），105.1（C-10），22.2（CH3）。以上数据与文献[17]基本一致，鉴定化合物6 为5，7-二羟基-2-甲基色原酮（5，7-dihydroxy-2-methyl chromone）。

化合物7：白色粉末，易溶于甲醇。HRESI-MSm/z：265.1446 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.74（1H，d，J＝16.2 Hz，H-4），6.16（1H，d，J＝16.2 Hz，H-5），5.93（1H，s，H-8），5.80（1H，s，H-2），2.54（1H，d，J＝16.8 Hz，H-10a），2.19（1H，d，J＝16.8 Hz，H-10b），2.01（3H，s，H-15），1.95（3H，s，H-14），1.08（3H，s，H-13），1.05（3H，s，H-12）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：170.9（C-1），121.2（C-2），165.5（C-3），128.5（C-4），134.8（C-5），79.2（C-6），145.6（C-7），126.0（C-8），199.7（C-9），49.3（C-10），41.4（C-11），18.3（C-12），22.2（C-13），23.2（C-14），19.6（C-15）。以上数据与文献[18]基本一致，鉴定化合物7 为脱落酸（abscisic acid）。

化合物8：白色固体，易溶于氯仿。HRESI-MSm/z：197.0814 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：11.81（1H，s，OH），6.29（1H，d，J＝2.5 Hz，H-3），6.24（1H，d，J＝2.5 Hz，H-5），4.42（2H，q，J＝7.2 Hz，OCH2CH3），2.50（3H，s，6-CH3），1.44（3H，t，J＝7.1 Hz，OCH2CH3）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：105.9（C-1），165.4（C-2），101.3（C-3），160.1（C-4），111.2（C-5），144.0（C-6），171.6（C ＝O），61.3（OCH2CH3），14.2（OCH2CH3），24.3（6-CH3）。以上数据与文献[19]基本一致，鉴定化合物8 为苔色酸乙酯（ethyl orsellinate）。

化合物9：白色粉末，易溶于氯仿、甲醇。HR-ESI-MSm/z：153.0552 [M ＋H]＋。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.89（2H，d，J＝8.8 Hz，H-2，6），6.84（2H，d，J＝8.8 Hz，H-3，5），3.86（3H，s，4-OCH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：120.6（C-1），131.3（C-2，6），114.8（C-3，5），162.4（C-4），170.5（C-7），50.8（OCH3）。以上数据与文献[20]基本一致，鉴定化合物9 为4-甲氧基苯甲酸（4-methoxybenzoic acid）。

化合物10：白色结晶，易溶于甲醇。HRESI-MSm/z：169.0473 [M ＋H]＋。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δ：7.57（1H，brs，H-2），7.59（1H，m，H-6），6.88（1H，d，J＝8.7 Hz，H-5），3.91（3H，s，OCH3）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：123.9（C-1），112.4（C-2），151.3（C-3），147.3（C-4），114.4（C-5），121.7（C-6），168.6（COOH），55.0（OCH3）。以上数据与文献[21]基本一致，鉴定化合物10 为香草酸（vanillic acid）。

4 讨论

本次研究从藤石松中分离得到10 个非生物碱类化学成分，包括1 个糠醛类（1）、1 个脂肪族类（2）、3 个苯丙素类（3 ～5）、1 个色原酮类（6）、1 个倍半萜类（7）、3 个简单芳香族类（8 ～10），经检索PubMed、EBSCO-Medline、SciFinder 等数据库，确定化合物1 ～10 均为首次从藤石松属植物中分离得到，丰富了藤石松的化学成分类型。

同时，通过文献调研发现，富马酸单甲酯（2）对牛奶酸败混合菌的生长具有较好的抑制作用[22]。咖啡酸乙酯（5）具有抗肿瘤活性[23]和较强的抗氧化和体外降血糖作用[24]。脱落酸（7）可改善或治疗炎症性肠病、糖尿病及动脉粥样硬化[25]。苔色酸乙酯（8）具有体外抗菌作用[26]。这些报道表明富马酸单甲酯（2）、咖啡酸乙酯（5）、脱落酸（7）和苔色酸乙酯（8）等有可能是藤石松发挥抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降血糖和抗炎等作用的活性成分，且与藤石松的镇痛消肿、跌打损伤等传统功效也可能存在关联性。

从藤石松中分离得到多种类型的化学成分，再进行药理实验或者对其进行生物活性文献调研，为进一步研究藤石松化学成分的多样性与生物活性的关联性奠定了基础，也有利于阐明藤石松传统功效的物质基础。