呋塞米与牛血清白蛋白相互作用的研究及共存金属离子的影响

刘 里， 成飞翔

(曲靖师范学院 化学化工学院，云南 曲靖 655011)

呋塞米与牛血清白蛋白相互作用的研究及共存金属离子的影响

刘 里， 成飞翔

(曲靖师范学院 化学化工学院，云南 曲靖 655011)

利用紫外和荧光技术研究了在优化的实验条件下，呋塞米与牛血清白蛋白(BSA)相互作用及常见金属离子对 BSA-呋塞米体系的影响.结果表明Pb2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Cu2+对呋塞米与BSA的结合有明显竞争作用.发现呋塞米对BSA有较强的荧光猝灭作用，测定了该反应的表观结合常数、结合位点数及结合位置.根据热力学参数确定了该药物与BSA之间的作用力类型，两者之间的作用力类型主要为范德华力和氢键.呋塞米在BSA中的结合位点主要位于亚螺旋域ⅡA.Hill系数约等于1，表明呋塞米对结合作用几乎无协同作用.同时应用同步荧光技术研究了呋塞米对BSA构象的影响.

呋塞米;牛血清白蛋白;相互作用;金属离子

呋塞米具有利尿、扩张血管的药理作用.临床上用于治疗水肿、高血压、急性肺水肿和脑水肿[1].目前，分子光谱法研究药物分子与血清白蛋白(BSA)的相互作用已有报道[2-4]，但呋塞米与BSA 相互作用的研究尚未见报道.以往研究药物与BSA相互作用主要集中在猝灭机理上，而本文除了采用两种分子光谱法研究了呋塞米与BSA之间的作用机理及结合特征，还深入探讨了两者的结合位置、药物之间的协同性以及金属离子对呋塞米与BSA结合反应的影响，这些比较深入的研究对于更全面的了解药物在体内与血清白蛋白的结合情况及金属离子对反应的影响具有重要意义.

1 实验部分

1.1 所用仪器与试剂

F-4600荧光分光光度计(日本日立公司)，Cary 50型紫外可见分光光度计(美国瓦里安技术中国有限公司)，精密酸度计：pHS-3C，上海虹益仪器仪表有限公司，超级恒温水浴锅(DHG-9035A型，上海一恒科技有限公司).BSA配制成浓度为1.0×10-4mol/L的储备液，呋塞米(中国药品生物制品检定所)配制成浓度为1.2094×10-3mol/L的储备液，这两者药品都需在4 ℃的冰箱中保存.其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水.

1.2 实验方法

在10.0mL容量瓶中依次加入0.5mol·L-1NaCl溶液2.0mL以保持反应体系的离子强度；0.2mol·L-1，pH=7.4的K2HPO4-柠檬酸缓冲溶液2.0mL；1.0×10-5mol/L的BSA 1.5mL和不同体积的1.2094×10-4mol·L-1的呋塞米溶液，定容至10mL，静置5min后进行荧光测定.激发光波长280nm，激发和发射狭缝宽度均为5nm.荧光分光光度计记录荧光光谱，于1cm石英池中分别测量F0和F(F和F0分别指呋塞米存在与不存在时BSA的荧光强度).

2 结果与讨论

2.1 反应条件的优化

分别考察了缓冲溶液、pH值、缓冲溶液的用量、BSA的浓度、试剂加入顺序以及反应时间对体系荧光强度的影响，结果表明，选用0.02mol/L，pH=7.40的K2HPO4-柠檬酸缓冲溶液2mL调节酸度，1.5×10-6mol/L BSA作为反应浓度，NaCl→K2HPO4-柠檬酸→BSA→呋塞米的加入顺序，放置5分钟后进行实验测量.

2.2 荧光光谱

在实验条件下，呋塞米没有荧光的，而BSA有较强的荧光，并在λex/λem=280/340nm处.当激发波长为280nm时，呋塞米-BSA在346nm处有一最大荧光峰，随着药物浓度的不断增加，荧光强度有规律的降低，如图1所示.荧光光谱结果表明BSA与呋塞米可能发生了相互作用.

2.3 呋塞米对BSA的猝灭机制

荧光猝灭机理分动态和静态二种[5]，它们都符合Stem-Volmer方程[6]，即：F0/F=1+Kqτ0[L]=1+Ksv[L]，式中：Kq为速率常数；Ksv为猝灭常数；[L]为呋塞米的浓度.不同温度下，以F0/F与[L]作图，得到的Kq、Ksv及相关系数r(表1).与扩散有关的，温度增加将使Ksv变大的是动态猝灭；而静态猝灭时，温度升高导致配合物稳定性下降，导致Ksv减小.因此，可利用Ksv随温度的变化情况来判别猝灭机理[6].由表1可见，升高温度，Ksv降低，推测是静态猝灭过程.

表1 三个温度下呋塞米对BSA的猝灭常数Tab.1 Quenching constant at three temperatures

若猝灭过程为静态猝灭，更应符合L-B方程[7]：(F0-F)-1=F0-1+(KLBF0[L])-1，式中KLB为静态荧光猝灭结合常数.根据L-B方程计算，结果见表2.从表2可以看出，三个温度下的相关系数都达到0.99以上，其KLB值都在104数量级，表明呋塞米与BSA的作用符合静态猝灭的特征.

对于静态猝灭，由于在基态时生成不发光的配合物，从而引起BSA紫外吸收光谱的变化[6].而动态猝灭只影响荧光分子的激发态，并不改变荧光物质的吸收光谱[6].因此可通过紫外光谱来确定呋塞米对BSA的猝灭类型.图2为加入呋塞米前后BSA紫外光谱的变化对比图.从图2可以看出，相比较于BSA(1) 、呋塞米(2) 叠加后的吸收光谱(3) ，加入呋塞米后 BSA的吸收光谱(4)峰的位置(移动5nm)和强度(减弱了三分之一)发生了明显变化，因此，进一步证明呋塞米对BSA荧光的猝灭过程是由静态猝灭引起的.

2.4 结合常数Kb和结合位点n

假设探针小分子L与生物大分子B存在n 个等同且独立的结合位点，L与B之间相互作用关系即荧光强度与猝灭剂可用双对数方程:lg[(F0-F)/F]=lgKb+nlg[L]进行描述[2-4]，分别在292K、307K、322K温度下绘制呋塞米与BSA的lg(F0-F)/F-lg[L]的双对数可得到一条直线.根据截距和斜率求得相应的Kb和n，见表3.由表3可看出，线性良好，结合位点数n接近1，表明呋塞米与BSA可形成1个结合位点； Kb为较大，表明呋塞米与BSA之间有较强的结合作用，可以被蛋白质运输和储存.

表2 L-B线性回归方程的相关参数Tab.2 Correlative parameters of the linear regression equations of L-B plots

表3 结合常数Kb和结合位点数nTab.3 The apparent binding constants (Kb) and the binding sites(n)

2.5 热力学参数及作用力

判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型，按照文献[7]的方法计算292K、307K、322K温度下自由能变ΔG、熵变ΔS以及焓变ΔH的大小；计算结果如表4所示.依据Ross等[8]的判断规则，ΔH<0，ΔS<0判断出BSA与呋塞米之间的作用力是氢键和范德华力；ΔH<0表明反应为放热反应，ΔG越小越有利于反应的进行.

表4 热力学参数值Tab.4 Thermodynamic parameters

2.6 结合位置的确定

BSA是由二硫键连接起来的几个螺旋状区域所组成的[2].药物与BSA结合位点分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ.位点Ⅰ位于亚螺旋域ⅡA，而位点Ⅱ和Ⅲ位于亚螺旋域ⅢA的疏水腔中[2].在激发波长中，BSA的色氨酸和酪氨酸残基的荧光能够同时激发的发波长为280nm，在这一波长上两氨基酸都能同时被激发；而激发波长为295nm时，只激发BSA的色氨酸残基的荧光[2].由图3可知，在激发波长为280nm和295nm时，呋塞米对BSA的猝灭曲线没有重叠，且在280nm时的蛋白荧光猝灭比295nm时的猝灭程度大，表明在呋塞米与BSA的反应中色氨酸和酪氨酸残基都参与了作用.因此可以判定，呋塞米与BSA的结合位点是主要位于亚螺旋域ⅡA.

2.7 药物的协同性

BSA具有多重结合部位，药物与BSA结合时，BSA各结合部位之间存在相互影响作用，这种相互影响作用称为药物的协同作用[2-4]，可用Hill方程[2-4]进行分析.按照文献[2-4]的方法计算呋塞米-BSA的 nH值，列于表5中.表5中，三个温度下nH约等于1，表示呋塞米与BSA结合后，不影响后继呋塞米与BSA的结合，即呋塞米间无协同性，这时每一个呋塞米与BSA的结合过程以独立的方式进行.

2.8 呋塞米对BSA构象的影响

固定BSA，逐步改变呋塞米的浓度，分别在Δλ=15nm和Δλ=60nm，测得BSA中酪氨酸残基的同步荧光光谱见图4(a)和色氨酸残基的同步荧光光谱见图4(b).由图可知，由于探针小分子呋塞米与BSA 的结合，导致BSA的色氨酸残基所处环境的疏水性降低，最大发射波长向长波移动，说明探针小分子加入引起了BSA 构象的变化.

表5 三个温度下体系的nHTab. 5 nH of systems at three temperatures

3 金属离子的影响

金属离子的存在会影响药物与白蛋白的结合能力，即影响药物与血清白蛋白的结合常数[2-4].从表6可知，在Pb2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Cu2+的存在下呋塞米与BSA间的Kb'及n均有不同程度的减小，说明金属离子参与了呋塞米与BSA的结合过程.由于 BSA 可与许多金属离子发生作用，各种金属离子与 BSA 的结合部位不同，结合力也有差别，所以Kb减小的程度各不相同.因此金属离子对于呋塞米与BSA之间作用的影响，主要是由于金属离子与BSA之间的作用，产生间接竞争的结果，导致药物分子与BSA之间的作用力降低，从面影响药物分子的治疗作用.

表6 金属离子对呋塞米与BSA结合的影响Tab. 6 The influence of Metal ions on Furosemide with BSA

4 结论

用荧光光谱法和紫外-可见吸收光谱法研究了呋塞米和BSA的结合作用.研究表明：呋塞米与BSA形成复合物，从而猝灭BSA的内源性荧光，该过程为静态猝灭过程.计算了不同温度下结合位点数和结合常数，确定了结合位置在BSA的亚螺旋域ⅡA 中.热力学参数表明两者结合时可能是氢键和范德华力起主要作用.同步荧光光谱表明加入呋塞米后BSA构型的变化.在结合过程中，呋塞米之间无协同作用.金属离子的存在对两者的结合产生了竞争作用.

[1] 杨阿喜.呋塞米的电化学性质及伏安法测定[J].药物分析杂志, 2010,30(5):915.

[2] 刘保生,王晶,薛春丽,等.头孢噻肟钠和氯霉素与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱分析[J].发光学报,2011,32(6):630-631.

[3] SULKOWSK A, BOJKO B, ROWNICKA J， et al. Paracetamol and cytarabine binding competition in high affinity binding sites of transporting protein[J]. J Mol Struct, 2006,27(12):249-256.

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[5] LAKOWICZ J R. Principles of fluorescence spectroscopy 3rd ed[M]. Springer Press, New York, 2006,280.

[6] 许金钩，王尊本.荧光分析法(第三版)[M].北京:科学出版社,2006:67-79.

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Study on the Interaction Between Furosemide with Bovine Serum Albumin and the Effect of Coexistent Metal Ion on the Reaction

LIU li， CHENG fei-xiang

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Qujing Normal University，Qujing 655011，China)

The interaction between Furosemide and bovine serum albumin (BSA) was studied under the optimal conditions by ultraviolet and fluorescent technique. The effect of common metal ions on the BSA-Furosemide system was also researched．Results show that Pb2+、Mg2+、Co2+、Fe3+、Cu2+have obvious competitive effect on the binding． It is shown that Furosemide has a powerful ability to quench the fluorescence of BSA. The reaction of apparent binding constant, binding points, and combined with location were determined. According to the thermodynamic parameters, thermodynamic parameters were obtained, which indicated that the action force was mainly van der Waals force and hydrogen bonds. The primary binding site for Furosemide was located at sub-domain ⅡA of BSA. The values of Hill's coefficients were nearly 1, which indicated that there was nearly no cooperative effect. In addition, the effect of Furosemide on the conformation of BSA was analyzed by synchronous fluorescence spectroscopy.

furosemide; bovine serum albumin; interaction; metal ions

10.14182/J.cnki.1001-2443.2015.05.009

2014-10-25

国家自然科学基金资助项目(21261019)；云南省教育厅科研项目(2015C090Y).

刘里(1982-)，女，满，吉林省吉林市人，讲师，主要从事药物化学和分子发光学理论与应用研究.

刘里，成飞翔.呋塞米与牛血清白蛋白相互作用的研究及共存金属离子的影响[J].安徽师范大学学报：自然科学版，2015，38(5)：450-454.

O657.3

A

1001-2443(2015)05-0450-05