2019年福建某原种猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因的遗传变异分析

林楚云，刘建奎，林志锋，林日丹，杨小燕*，戴爱玲*

(1.福建农林大学动物科学学院，福建福州 350002；2.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364000；3.福建省生猪疫病防控工程技术研究中心，福建龙岩 364000)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种严重危害养猪产业的重要病毒性传染病[1]。PRRSV为单股正链RNA病毒，基因组全长15 kb，至少包含10个开放阅读框(open reading frame,ORF)，其中ORF1中的Nsp2、ORF3、ORF5a和ORF5等基因高度变异，而ORF5基因的变异情况在很大程度上可以反映PRRSV基因组的遗传变异特征。PRRSV分为欧洲型和美洲型2种基因型，我国的流行毒株以美洲型毒株为主。PRRSV基因组存在高度的变异，先后出现经典毒株、高致病性PRRSV(HP-PRRSV)毒株及类NADC30毒株[2]，给该病的防控带来了极大的挑战。

2019年11月，福建省某PRRS疫苗非免疫存栏能繁母猪700头的原种猪场，母猪先后出现早产、产弱仔，保育猪出现扎堆、嗜睡、喘气、体温升高、采食量下降等临床症状，病死率近10%。临床剖检3头保育猪，肺部可见间质性肺炎，全身淋巴结轻度水肿，其中1头出现心包炎病变。通过3头保育猪的临床特征和病理剖检，初步诊断为PRRSV感染，为进一步确诊并了解PRRSV毒株流行情况，采集2周龄～8周龄的临床疑似发病的保育猪全血，4 ℃保存，送往实验室进行PRRSV RT-PCR检测及ORF5基因序列分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 样品采集于存栏700头的福建某原种猪场，采集2周龄～8周龄各周龄段临床疑似发病保育猪全血各5份，将相同周龄的5份全血各取50 μL，合为1份，并命名为2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W。

1.1.2 试剂 总RNA提取试剂盒，北京天根生化有限公司产品；Random Primer、Oligo (dt)18 Primer、Reverse Transcriptase M-MLV反转录酶(200 U/μL)、TaKaRaTaq聚合酶(5 U/μL)、Recombinase RNase Inhibitor(40 U/μL)、DNA标准DL 1 000 、dNTP,宝生物工程(大连)有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 引物设计与合成 按照参考文献[3]的方法设计PRRSV ORF5基因特异性引物，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，扩增目的片段大小约为700 bp。

1.1.4 仪器设备 台式高速冷冻离心机(CL31R)、二氧化碳培养箱(3111)，Thermo Fisher Scientific公司产品；PCR仪(MycycLerTM)、凝胶成像系统(GeL Doc TMXR)，美国Bio-Rad公司产品；超净工作台(SW-CJ-1D)，苏州净化设备有限公司产品；电泳仪(DYY-2C)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料核酸的提取 取2周龄～8周龄保育猪全血，进行RNA提取，方法参照北京天根生化有限公司总RNA提取试剂盒说明书。

1.2.2 RT-PCR 检测 RT-PCR反应如下：取16 μL的RNA，分别加入1 μL Random Primer、1 μL Oligo (dt)18 Primer，以18 μL体系用PCR仪进行70 ℃ 10 min，4 ℃ 2 min；反应结束后直接加入4 μL 5× M-MLV buffer、2 μL dNTP、1 μL RTase M-MLV、1 μL Recombinase RNase Inhibitor，以26 μL体系用PCR仪进行30 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，4 ℃ 10 min，所得产物即为cDNA。取2 μL 模板cDNA，加入ORF5上、下游引物各1 μL，2.5 μL 10× PCR buffer，2 μL dNTP，0.2 μLTaq，16.3 μL ddH2O；PCR反应程序为：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。同时设不加模板的阴性对照。取10 μLPCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并以DNA标准DL1 000为对照，观察目的条带和判断结果。

1.2.3 序列测定及分析 将阳性PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。利用DNA Star软件对ORF5基因序列与GenBank中收录的PRRSV ORF5基因序列的核苷酸进行同源性分析，并应用Mega6.0软件绘制进化树。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果

2周龄～8周龄保育猪全血经RT-PCR后凝胶电泳鉴定。结果显示，5W、6W、7W、8W保育猪全血均扩增出与预期大小一致的目的条带约700 bp，而2W、3W、4W保育猪全血均未扩增出与预期大小一致的目的条带(图1)，表明该猪场5周龄～8周龄保育猪存在PRRSV感染。

2.2 核苷酸同源性分析

经生工生物工程(上海)股份有限公司测序并进行Blast比对，所测得的序列为PRRSV ORF5基因特异性的序列。经PRRSV ORF5基因核苷酸同源性分析，5W毒株ORF5基因与HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4和TJ同源性最高为95.4%～95.6%，与VR2332和疫苗毒株Resp PRRS MLV为经典毒株代表毒株的同源性为87.4%，与谱系3代表毒株QYYZ、FJFS的同源性为82.3%～82.7%，与类NADC30 PRRSV代表毒株NADC30、FJZ03、FJY04和CHsx1401同源性为84.1%～84.6%；6W、7W、8W毒株的ORF5基因与类NADC30 PRRSV代表毒株NADC30、FJZ03、FJY04和CHsx1401同源性较高，分别为88.9%～91.1%、89.6%～91.9%和89.3%～91.6%，与VR2332和疫苗毒株RespPRRS MLV为经典毒株代表毒株的同源性分别为83.5%、83.7%和83.7%，与谱系3代表毒株QYYZ和FJFS同源性分别为83.3%～84.2%、83.5%～84.2%和83.7%～84.4%，与HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4和TJ同源性分别为85.4%、85.6%和85.6%(图2)。综上所示，该猪场5W保育猪感染的是HP-PRRSV毒株，6W-8W保育猪感染的是类NADC30毒株。

M.DNA 标准DL 1 000;1.2W；2.3W；3.4W；4.5W；5.6W；6.7W；7.8W；8.阴性对照

2.3 核苷酸遗传进化树

遗传进化树表明，5W毒株与JXA1、HuN4和TJ的HP-PRRSV代表毒株处于同一分支，亲缘关系较近，而与NADC30、VR2332、QYYZ、FJFS等代表毒株处于不同分支，亲缘关系较远；6W、7W、8W毒株与NADC30、FJZ03、CHsx1401等类NADC30 PRRSV代表毒株处于同一分支，亲缘关系较近，而与JXA1、QYYZ、VR2332等代表毒株处于不同分支，亲缘关系较远(图3)。综上结果表明，该猪场5W毒株为HP-PRRSV毒株；6W、7W、8W毒株均为类NADC30毒株。

图2 PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性分析

图3 PRRSV ORF5基因核苷酸的遗传进化树

3 讨论

1987年，PRRS首次在美国被发现并报道，之后迅速传播至许多国家。1995年，中国首次分离出PRRSV CH-la毒株。2006年，中国南部部分地区发现HP-PRRSV，其高致病性、高病死率给养猪业造成了巨大的损失。2001年末，美国发现PRRSV变异株，其特征是Nsp2存在131个不连续的氨基酸缺失，缺失模式为“111+1+19”。2008年，美国国家动物疾病研究中心(NADC)首次命名NADC30毒株[4-5]。自2012年起，我国陆续分离到与NADC30同源关系较近的毒株(ORF5基因同源性 97%)，且具有特征性的“111+1+19”缺失模式，因此目前国内将这类病毒统称为类NADC30毒株[6]。ORF5基因编码的囊膜蛋白GP5是PRRSV 基因组中高变区之一，是PRRSV主要的糖基化囊膜蛋白及重要保护性抗原，是变异最大的结构蛋白[7]。因此，ORF5基因常作为PRRSV分子流行病学调查及变异分析的研究切入点。

本文通过对PRRSV ORF5基因进行分析，结果显示，5W保育猪全血中的PRRSV ORF5基因与HP-PRRSV代表毒株同源性最高；6W、7W、8W 保育猪全血中的PRRSV ORF5基因与类NADC30代表毒株同源性较高。结果表明，该猪场保育猪存在类NADC30和HP-PRRSV毒株混合感染。2019年，申欢欢等[8]报道了某规模化猪场存在类NADC30、HP-PRRSV和PRRSV毒株混合感染。中国是畜牧大国，复杂的饲养环境，频繁的生猪运输和不当的引种，使毒株变异频发[9]，且类NADC30毒株与以往PRRSV毒株不同，该病毒与其他病毒重组率高，加重了猪场防疫的难度[10-11]。刘磊等[12]报道了2016年-2018年广西地区14个地区规模化猪场以HP-PRRSV毒株流行为主，但2018年出现了与美国NADC30处于同一分支的类NADC30毒株和与GM2处于同一分支的经典株与变异株的重组毒株。袁为锋等[13]报道了2016-2017年江西地区的美洲型毒株出现多基因亚型共存的局面，以HP-PRRSV为主，类NADC30毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高。本课题组刘建奎等[9]报道了2013年福建省开始流行类NADC30毒株，并在2014年逐渐取代HP-PRRSV，成为优势毒株。外部环境中不同PRRSV毒株可通过多种途径入侵猪场内部，易增加猪场内猪群野毒感染和毒株变异的风险。

据笔者调查，2018年10月引种前该猪场的PRRSV抗体监测记录，母猪PRRSV抗体阳性率在40%～50%，猪场处于PRRSV阳性稳定状态。引种后备猪有采取隔离措施，但混群后猪群还是出现了不稳定状态，2019年7月监测母猪PRRSV抗体阳性率100%。本次RT-PCR检测结果显示该猪场5周龄～8周龄保育猪全血检出PRRSV，存在PRRSV病毒血症，临床上暴发比较典型的PRRS症状。据郭林等[14]跟踪与监测PRRSV抗体消长规律的结果，在未免疫任何PRRSV疫苗的猪场，PRRSV母源抗体在断奶后2周(40日龄左右)降到最低。因此，断奶后的保育猪因为母源抗体消失、自身的免疫系统还没有完善、生长速度加快、场内外PRRSV毒株情况复杂、断奶及转栏应激等多种因素使这个阶段的猪易暴发PRRS。该猪场由于受非洲猪瘟疫情的影响，为了加强生物安全，减少猪群出栏次数，存在断奶后保育猪存栏密度过大、氨气浓度过高和冬季时没有及时调整好猪舍环境等问题，进而导致保育猪群PRRS的暴发，该场没有采取紧急免疫PRRSV疫苗的措施，实行部分保育猪及中大猪的部分清群，淘汰没有治疗价值的发病猪，减少保育猪、中大猪的密度，同时添加药物控制继发感染和中药类产品提高抵抗力等措施。曲向阳[15]证明当母猪群不稳定时，感染仔猪免疫PRRSV弱毒疫苗会增加死淘率。因此，对于非免疫PRRSV疫苗猪场的猪蓝耳病的防控，首先严把引种关，尽量在同一猪场引种，保障隔离时间，监测隔离猪群的PRRSV毒株类型。在毒株型不同的情况下，尽量在抗原阴性时进行本场毒株的驯化工作；其次，猪场要建立PRRSV监测方案，降低猪场内PRRSV的污染与病毒载量，阻断病毒在猪群中间的循环与传播；最后，改善猪场设备，如增加负压空气过滤系统，它可以有效的阻断由空气传播所导致的PRRSV感染[16]。

PRRS作为危害养猪业的重要疫病，目前主要防疫措施包括生物安全、免疫策略、感染状态监控等。不管哪种防控措施，毒株多样化导致患病猪临床表现多变和疫苗保护效力不佳，都给猪场的防控造成极大的困难。毒株驯化和封群管理是PRRS防控的重要方向，但国内尚无利用该技术在区域化或大型养猪企业成功净化PRRSV的报道。