牦牛源副乳房链球菌的分离鉴定及部分生物学特性分析

罗弼豪，韩雪英，常振宇，郭抗抗

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000)

副乳房链球菌(Streptococcusparauberis，Spu)是一种球型、短链状排列的革兰氏阳性菌，无运动性，能够引起多种动物疾病并表现出血性败血症、眼球突出症、脑膜炎、恶病质等临床症状，在短时间内病死率可达50%以上，给养殖业造成了极其严重的损失[1]。1996年，该菌最早发现于西班牙北部的大菱鲆养殖场，被认定是鱼类的一种重要病原菌[2]。此后，在污染的肉制品、奶牛乳房炎乳汁和病死猪肺脏中相继分离鉴定出副乳房链球菌[3-5]，但是目前并没有关于牦牛源副乳房链球菌的相关报道。2019年，对青海省某养殖场出现呼吸道疾病的牦牛肺脏组织进行了细菌培养，通过对分离菌的形态特征观察、生化试验、16S rDNA序列分析等确定了3株副乳房链球菌，并进行了小鼠致病性试验和药物敏感性研究，旨在为牦牛中副乳房链球菌的基础研究和防控提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品与实验动物 肺脏组织采自青海省某规模化牦牛养殖场，无菌采集后，干冰保存并及时送实验室进行细菌分离。4周龄～6周龄清洁级昆明小鼠30只，雌雄各半，体重20 g左右，购自华中农业大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 血平板，青岛海博生物技术有限公司产品；胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，武汉科瑞生物技术有限公司产品；标准小牛血清、pMD19-T 载体、大肠埃希氏菌DH5α，北京天根生化科技有限公司产品；生化反应试剂、药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司产品；细菌DNA提取试剂盒、16S rDNA PCR试剂盒、DNA标准DL 2 000，杭州新景生物试剂开发有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 PCR扩增仪(S-1000)、稳压稳流电泳仪、凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司产品；全自动半封闭脱水机(TP1020)、染色机，YAGUANG公司产品；病理石蜡包埋机(LS-100)、自动恒温摊烤烘片机(GTK-2002)，湖北贝诺医疗科技有限公司产品；石蜡切片机(LEICA RM 2126)，德国Leica公司产品；倒置显微镜(Motic AE2000)，麦克奥迪实业公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 无菌采集的肺脏用常规方法划线接种于TSA培养基(含50 mL/L小牛血清)，37 ℃培养24 h后挑取半透明、光滑、圆形，伴有少量荧光的可疑菌落进行纯化培养。将纯化菌落接种于血平板上观察溶血情况。对分离纯化的细菌进行载玻片涂片、革兰氏染色、显微镜观察。

1.2.2 分离菌株的生化鉴定 将分离菌株接种于TSA培养基上，按常规方法使用细菌微量生化反应管进行试验，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[6]判定并分析结果。

1.2.3 分离菌株的16S rDNA鉴定 利用高温裂解法提取分离菌株的基因组DNA，并利用16S rDNA通用引物(F:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)对分离菌株进行PCR扩增。引物由北京擎科新业生物技术有限公司合成，16S rDNA扩增长度约1 500 bp。PCR 反应体系50 μL：2×PCR Mixture 25 μL，ddH2O 21 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物各1 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。将阳性PCR产物回收后与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，将阳性克隆送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。

1.2.4 分离菌株的同源性分析及系统发育树的构建 将测序获得的16S rDNA序列利用Blast软件与GenBank数据库中已公布的副乳房链球菌16S rDNA基因序列进行同源性比对分析，并采用Mega 6.0软件构建系统进化发育树。

1.2.5 致病性试验 将纯化好的单菌落接种于TSB培养液(含50 mL/L小牛血清)中，置37 ℃恒温摇床培养24 h，计数并用生理盐水将菌液稀释后用于动物感染试验。将小鼠随机平均分为3组(n=10)：低剂量组(LD)、高剂量组(HD)和对照组(C)，各组小鼠分别腹腔注射6.4×109CFU菌液、9.6×109CFU菌液和TSB培养液。接种后每日观察小鼠临床症状和死亡情况并做好记录，剖检死亡小鼠并无菌采集肝脏、肺、脾脏等组织，用多聚甲醛(40 mg/mL)固定，进行HE染色。

1.2.6 药物敏感性试验 采用K-B 纸片扩散法[7]进行药物敏感性试验，依据美国临床实验室标准委员会(CLSI)推荐的抗菌药物敏感性试验执行标准判定结果。

2 结果

2.1 分离菌株的形态特征

对肺脏组织进行细菌分离，结果分离纯化得到3株优势菌株；分离菌株在TSA(含50 mL/L小牛血清)长出半透明、光滑、圆形、伴有少量荧光的单菌落；血平板上长出灰白色、突起、光滑、边缘整齐菌落，有α 溶血现象。革兰氏染色结果可见，分离菌株为革兰氏阳性的成双或短链状排列的短杆菌或球杆菌(图1)，将其命名为Spu-1、Spu-2和Spu-3。

2.2 分离菌株的生化鉴定

生化鉴定结果显示，分离菌株发酵甘露醇、菊糖和水杨苷，不发酵鼠李糖和乳糖，其中Spu-1和Spu-3发酵葡萄糖、蔗糖和海藻糖，不发酵山梨醇，而Spu-2发酵山梨醇不发酵葡萄糖、蔗糖和海藻糖(表1)。参考伯杰氏细菌鉴定手册分析，Spu-1、Spu-2和Spu-3分离株均符合副乳房链球菌的生化特性。

图1 副乳房链球菌革兰氏染色镜检结果(1 000×)

表1 分离株生化试验结果

2.3 分离菌株16S rDNA鉴定

提取分离菌株的基因组DNA进行16S rDNA扩增，产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果显示，扩增出的片段大约在1 500 bp(图2)，与预期的基因片段大小相符。

2.4 分离菌株同源性分析及系统发育树的建立

将测序得到的16S rDNA基因序列经Blast比对分析，分离菌株的16S rDNA基因序列与GenBank中副乳房链球菌相应序列同源性在99%。利用Mega 6.0 软件采用邻接法构建系统发育树，发现分离菌株Spu-1、Spu-2和Spu-3与副乳房链球菌SPOF3K相似(CP025420.1)聚为一簇，进一步证实了分离菌株为副乳房链球菌(图3)。

M.DNA 标准DL 2 000;N.阴性对照;1～3.分离株

2.5 分离菌株致病性试验

本研究选取病变最严重的肺脏分离株Spu-1，腹腔注射昆明小鼠进行致病性试验。结果显示，低剂量组和高剂量组小鼠20 h内均死亡，对照组小鼠均存活并且十分活跃。通过肺、肝、脾、肾的HE染色可以发现，对照组小鼠各实质器官均没有明显病理变化。高剂量组和低剂量组肺脏组织出现严重出血，炎性细胞浸润，许多肺泡缩小甚至消失(图4A)。高剂量组和低剂量组脾脏组织瘀血、出血，有中性粒细胞浸润(图4B)。高剂量组和低剂量组肝脏组织瘀血，肝细胞变性、坏死，炎性细胞浸润(图4C)。高剂量组和低剂量组肾脏组织出血，以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞变性、坏死(图4D)。与高剂量组相比，低剂量组的组织病理学变化略轻。

图3 牦牛源副乳房链球菌分离株与参考菌株16S rDNA序列系统进化树

1.肺;2.脾;3.肝;4.肾;LD.低剂量;HD.高剂量;C.对照

2.6 药敏试验结果

选取临床常用的9种抗菌药物对分离菌株进行药物敏感性试验。按照CLSI动物源性药敏试验标准，以抑菌圈直径位于CLSI规定的耐药(resistance，简称R)、中敏(intermediate，简称I)、敏感(sensitive，简称S)值的范围判断试验结果。药敏试验结果表明，3株Spu对四环素和强力霉素有不同程度的耐药性， 所有Spu分离株均对链霉素耐药，对红霉素、阿奇霉素、万古霉素和麦迪霉素敏感或中度敏感(表2)，因此可以选用大环内酯类抗生素进行治疗。

表2 牦牛源副乳房链球菌分离株药敏试验结果

3 讨论

作为我国青藏高原地区的特有品种和优势家畜，牦牛是当地牧民不可或缺的物质来源和经济来源，其健康养殖对我国牧区的经济和社会发展具有重要战略意义[8-9]。然而牦牛多生活在高寒缺氧、昼夜温差大、牧草匮乏的高原高山地带，加上其以散养放牧为主的生产养殖模式，饲养管理条件差，容易诱发各种疾病，特别是传染病发生的频率大大增加[10]。因此关于牦牛致病原的研究至关重要，对于牦牛传染性疾病的防控具有实际指导意义。

副乳房链球菌是一种环境性致病菌，可以引起鱼类、猪和奶牛等多种动物的疾病，但是目前尚未见到牦牛感染副乳房链球菌的研究报告[11-14]。本研究采集了青海省牦牛肺脏样本，从中分离得到了3株副乳房链球菌，通过培养特性观察、生化特征鉴定和16S rDNA序列分析等方法对分离株进行鉴定，结果表明分离株与副乳房链球菌的同源性高达99%，根据细菌16S rDNA扩增序列同源性大于97%便归属于同一个种[15]的原则，可以确定本研究中分离株确实为副乳房链球菌。这是国内首次从牦牛中分离鉴定出副乳房链球菌。

本研究分离的3株副乳房链球菌经血平板培养均发现α 溶血现象，通常认为具有α 溶血特性的细菌为条件致病菌；此外，致病性试验也显示，小鼠腹腔注射Spu-1菌液后表现出明显副乳房链球菌感染症状，抑郁，厌食症，呼吸困难以及死亡，组织学检查发现小鼠的肝、肾、肺、脾等组织具有损伤，这些结果提示在兽医临床上不可忽视该细菌的致病作用及这种病原菌的对牦牛养殖业潜在威胁。

合理使用抗菌类药物是防治细菌性疾病的重要措施之一。此次药敏试验结果显示，在受试的9 种日常养殖常用的抗菌药物中，分离株对四环素和强力霉素有不同程度的耐药性，所有Spu分离株均对链霉素耐药，对红霉素、阿奇霉素、万古霉素和麦迪霉素敏感或中度敏感。因此，在治疗副乳房链球菌引起的相关疾病，可以根据药敏试验结果合理选择抗菌药物，以提高治疗效果。

本研究通过从牦牛肺脏中分离出副乳房链球菌，分析其形态特征、生化特性、对小鼠的致病性及对抗菌药物的敏感性，阐明了牦牛源副乳房链球菌的部分生物学特性，为牦牛副乳房链球菌的防控提供了科学依据。