鸽源鼠伤寒沙门氏菌的分离鉴定

亓玉卓,梁 琳，林伟东，刘 琪，2，梁瑞英，贾亚雄，张 莉，崔尚金*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；2.农业农村部兽用药物与诊断技术北京科学观测实验站，北京 100193；3.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109；4.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100097)

沙门氏菌病是由沙门氏菌引起的一种人畜共患病，10月龄内的鸽对其易感，鸽飞行能力也受其影响，该菌可通过损伤的皮肤、眼结膜、呼吸道及消化道传播，部分沙门氏菌也可通过鸽卵垂直传播[1]。沙门氏菌血清型分属35个群或亚群，感染禽类的沙门氏菌有38种，分属7个O群(O4、O7、O8、O9、O10、O11、O19)[2-3]。鸽沙门氏菌病主要由鼠伤寒型沙门氏菌引起，又称鸽副伤寒，传播方式主要是水平传播[4]，乳鸽的哺育通过母鸽经口腔喂食，鼠伤寒沙门氏菌可以在喂食过程中，从带菌母鸽经口腔直接传播给乳鸽；同时其排泄物也可成为传播源。污染的禽、肉等产品，也是沙门氏菌污染的一个来源。2003年，Capita R等[5]的调查结果显示，西班牙49%的鸡肉中含有沙门氏菌，污染率较高。2005年，国内也有报道深圳市售肉品中有26.2%也受到了沙门氏菌污染[6]。2008年，对兰州市肉与肉制品微生物污染状况调查结果显示，7.5%生猪胴体中可检出沙门氏菌[7]。2018年，在泰国肉鸡和猪中的感染率分别为18.05%和37.54%[8]。2019年，谢冠东[9]对北京市售鸽肉中沙门氏菌进行分离鉴定,检出率达21%。可见，沙门氏菌的污染情况十分普遍。随着养鸽业的发展，沙门氏菌将会拥有更多的传播途径，对食品卫生安全和人类健康存在潜在威胁[10]。因此，鸽场的沙门氏菌流行情况对公共卫生安全已经十分必要。

本试验从北京郊区某肉鸽养殖场疑似鸽副伤寒濒死的10日龄乳鸽各脏器中进行沙门氏菌的分离鉴定，分别采用16S rRNA基因测序、革兰氏染色、培养特性观察和生化试验，判定该菌为鼠伤寒沙门氏菌，通过药敏试验分析了其耐药性，以期为鸽场在疾病预防和用药方面提供理论参考[11]。动物回归试验，无论通过口服、肌注、静脉注射的攻毒方式都能使试验鸽死亡，用分离菌可复制得到原有特征性剖检病变，确定了该菌为此养鸽场的致病菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 北京某肉鸽养殖场发生乳鸽肛门周围黄绿色粪污，肝脏肿大，并造成死亡，疑似沙门氏菌感染，从该鸽场采集濒死10 日龄乳鸽1只；试验用健康鸽，购自北京市某肉鸽养殖场，经特定病原检测后确定为不带病健康鸽。濒死乳鸽在超净工作台内使用高压灭菌的器械剖检，无菌采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸肌于平皿，切下大约1 cm3大小的组织块置于15 mL 离心管内，加等体积PBS，使用手持电动研磨器对组织进行充分研磨，并采集病变明显的脏器制作成石蜡切片，记录病理变化。

1.1.2 主要试剂和培养基 无菌脱纤维绵羊血，北京索莱宝科技有限公司产品；麦康凯培养基、沙门氏菌选择性分离培养基XLD琼脂、沙门氏菌鉴别培养基SS琼脂、沙门氏菌鉴别培养基HE琼脂、MH琼脂，北京陆桥技术股份有限公司产品；药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司；2×La-Master Mix，南京诺唯赞有限公司；DNA标准 DL 2 000,北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 PCR仪，美国ABI公司产品；凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司产品；电泳仪，北京君意电泳设备有限公司产品；恒温培养箱(DHP9052B)，上海一恒科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离与纯培养 将无菌操作取得的病鸽内脏研磨后接种到血琼脂培养基，37 ℃恒温培养箱倒置培养24 h，然后观察菌落，根据其颜色、形态、溶血性、数目(菌落数目小于3的舍弃)，记录并选取各个不同类型菌落纯化、革兰氏染色和镜检[12]。

1.2.2 细菌鉴定

1.2.2.1 选择性培养基培养 将革兰氏阴性杆状的可疑致病菌首先接种于XLD琼脂、SS琼脂和麦康凯琼脂培养基。

1.2.2.2 生化试验 将纯化后的该株分离菌分别接种于生化鉴定管中[13](葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、黏酸盐、蔗糖、乳糖、水杨酸、棉子糖、半固体、MR、H2S、柠檬酸盐、尿素酶、V-P、吲哚)，37 ℃培养24 h后观察结果。

1.2.2.3 16S rRNA PCR扩增 采用天根试剂盒提取细菌基因组DNA，选用16S的通用引物，对菌株进行鉴定。引物序列如下：上游引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。引物由GENEWIZ生物科技有限公司合成。细菌DNA 2 μL作为模板，扩增体系50 μL: 16S上、下游通用引物各2 μL，2×La-Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 10 min;94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共32个循环；72 ℃ 6 min。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。将纯化后的PCR产物送英潍捷基公司测序，并将测序结果在NCBI数据库中以Blast程序进行同源性比对，从中选取相似性较高的代表菌株16S rRNA序列，用MEGA 6.0中Kimura-2参数矩阵的邻接法构建系统发育树。

1.2.2.4 血清学鉴定 将疑似沙门氏菌的分离株，按照国家标准GB4789.4-2016中的要求鉴定该疑似菌株的血清型[14]。首先用A～F多价O血清进行玻板凝集试验，同时设生理盐水作为对照，阳性凝集的再分别用其余的O单因子的各个血清分别进行检测。据此即可判定分离菌O抗原型。以Vi血清鉴定其Vi抗原，然后以H复合血清及H单因子血清鉴定其鞭毛抗原，参照说明书中沙门氏菌属抗原诊断表，根据其菌性特征，做出诊断。

1.2.3 药敏试验 参照美国临床实验室标准委员会( NCCLS-2018) 描述的K-B法的标准，对抑菌圈直径进行判定，检测分离菌株的耐药谱。检测的药敏纸片包含氨苄西林(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、美罗培南(20 μg/片)、庆大霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)、阿米卡星(30 μg/片)、链霉素(10 μg/片)、环丙沙星(5 μg/片)、氯霉素(30 μg/片)、呋喃妥因(300 μg/片，根据药敏试验判定耐药表型。

1.2.4 动物回归试验 分离菌株培养物经过平板计数后进行动物回归试验。将10日龄乳鸽进行随机分组，每组3只。培养新鲜已鉴定的病菌，分别以口服、肌注、静脉注射的方式进行攻毒(攻毒剂量108CFU/只)，每只0.2 mL。同时设置阴性对照组，以生理盐水代替菌液，每只0.2 mL。对病死鸽进行剖检和细菌分离。观察并记录剖检结果。

2 结果

2.1 临床症状和病理剖检

病鸽呈现精神萎靡不振、食欲下降、瘦弱的现象，乳鸽腹部发黑。剖检结果显示肝脏肿大较严重，呈暗红色，质地变脆，一触即破，边缘有坏死(图1A)；肾脏肿大，肠道发现有条状出血，脾脏肿大；胸腔有黄色纤维素性渗出(图 1B)。病理切片结果显示，肺脏主要表现为严重出血，血管扩张，肺内见大量粉红色渗出(图2A)；肝脏表现为炎症，主要集中在中央静脉周围淋巴细胞浸润(图2B)。

2.2 菌落形态及培养特性观察

该分离菌株在血平板上均呈现白色、湿润、中等大小的菌落。在XLD琼脂上呈现粉红色透明菌落，中间有黑色中心(图3A)。在HE琼脂上呈现蓝绿色菌落，中间有褐色中心(图3B)。SS琼脂培养基上的菌落形态均为无色半透明，菌落中心带有黑色(图3C)。在麦康凯培养基上均为圆形半透明灰白色菌落(图3D)。

A.肝脏肿大，质地变脆；B.胸腔有纤维素性渗出

A.肺脏出血；B中央静脉周围淋巴细胞浸润

2.3 革兰氏染色镜检

经革兰氏染色，油镜下观察到该菌为两端钝圆的革兰氏阴性短杆菌(图4)。

2.4 生化与血清学鉴定结果

2.4.1 生化鉴定结果 该分离株细菌可发酵葡萄糖(产酸和产气)、麦芽糖、甘露醇、黏液酸；不发酵蔗糖、乳糖、水杨酸、棉子糖。动力(半固体)、MR、H2S、柠檬酸盐利用试验呈阳性；尿素酶、V-P、吲哚试验呈阴性。参照生化鉴定试剂盒的说明书进行判断，结果表明该分离菌为沙门氏菌。

2.4.2 血清学鉴定结果 沙门氏菌A～F 多价O血清与分离的该株致病菌混合表现凝聚反应，沙门氏菌O4单价血清因子与分离得到的该株致病菌能发生凝集反应，且生理盐水作为阴性对照无凝集。分离菌抗原式符合说明书关于鼠伤寒沙门氏菌血清学抗原式的描述，初步鉴定该分离株为鼠伤寒沙门氏菌。

2.5 16S r RNA 序列分析鉴定结果

PCR扩增产物电泳结果显示,该分离菌株在约1 500 bp处扩增出条带(图5)。测序结果在NCBI数据库中以Blast程序进行同源性比对并建立遗传进化树(图6)，与鼠伤寒沙门氏菌同源性为100%。

图3 分离菌在不同培养基上的菌落形态

图4 分离菌株革兰氏染色镜检(1 000×)

2.6 药敏试验结果

药敏试验结果显示，分离菌对链霉素、呋喃妥因表现耐药，对氨苄西林、阿莫西林、美罗培南表现敏感(表1)。

M.DNA 标准DL 2 000;1.疑似沙门氏菌样本DNA；2.阴性对照

2.7 动物回归试验

2.7.1 攻毒后的临床症状和病理剖检 静脉注射的鸽子于感染后24 h出现精神萎靡、饮食欲下降，被毛松乱、身体颤抖、俯卧等症状，32 h后死亡。口服攻毒的鸽子在48 h后出现食欲下降，精神沉郁，扎堆、呼吸困难，浑身无力，趴伏不动等症状，在56 h后相继死亡。肌肉注射的鸽子同样在感染48 h后出现症状，症状与另外2个试验组鸽子相似，在感染70 h后死亡。对照组鸽子正常存活，未见任何不良反应。剖检发现试验组肝脏肿大，病程较长的胸腔有黄色纤维素性渗出，嗉囊内也有黄色干酪样物质，肾脏和脾脏都有不同程度的肿大，口服方式攻毒的，在肌胃和腺胃交界处有出血，腺胃乳头出血。

图6 分离株与沙门氏菌参考株的16S rRNA基因遗传进化树

2.7.2 攻毒鸽中的细菌分离与鉴定 将试验病鸽的肝脏、肾脏、心脏、脾脏分别接种到血平板中，不同脏器都可在血平板上培养出白色、湿润、中等大小的菌落，经鉴定，与攻毒菌同源性达100%，不同攻毒组均可以分离到纯净的该菌株，表明该分离菌株可以通过动物复制得到原有特征性剖检病变。

表1 药敏试验结果

3 讨论

肉鸽通常在鸽舍中饲养，清晨被放飞，自由放养的方式进行饲养，并经常与其他鸽子一起飞行，因此饲养过程中容易误食野生昆虫或饮用野外水源[15]。据报道，鸽子藏有60种不同的人类病原体，并导致176种人类确诊疾病[16]。Osman K M等[17]报道可从鸽子中分离出沙门氏菌和其他肠道致病菌。Horn和Saifullah等亦是在健康野生鸽中分离到具有多重耐药的沙门氏菌[15,18]。由此可见沙门氏菌在鸽群中是普遍存在的，其中，鸽源沙门氏菌病又主要由鼠伤寒型沙门氏菌引起。其自然宿主又为畜禽类，因此传播广泛，还可通过污染的畜禽产品感染人类。该菌的广泛传播已经严重威胁了人类和动物肠道健康，也严重危害养禽业发展[19]。近年来，随着特种经济动物饲养业的发展，无论是信鸽还是肉鸽的养殖规模不断扩大，鸽的各类传染病的较以前也更为频繁的出现，同时由于鼠伤寒沙门氏菌引起的细菌性传染病，在传播过程中出现了一些与以往不完全相同的病理特征以及各种耐药性的问题，这使鸽沙门氏菌病的诊断和治疗变得更为棘手[20-21]。据报道，沙门氏菌属有2个种，分为42个群，现有2 659种血清型[4]。现阶段鸡源性沙门氏菌的研究较多，对其的分离鉴定、毒力和耐药性等方面已经有许多学者进行了系统研究[22-24]，但对鸽源沙门氏菌的研究还十分有限[2]。

本试验通过对某肉鸽养殖场病鸽的剖检，结合临床症状的观察，利用SS琼脂培养基对各脏器中的菌种进行分离、纯化以及革兰氏染色镜检获得1株疑似致病菌的沙门氏菌。结合糖酵解试验、大分子物质水解试验、生化试验初步鉴定为沙门氏菌。继而进行血清型鉴定，结果表明分离的沙门氏菌血清型为 A～O群，本试验与报道的江苏地区的优势血清型差异较大[25]。沙门氏菌的部分血清型具有垂直传播性，能够从咽喉或肠道侵入母体内。具备这种垂直传播能力的沙门氏菌血清型包括白痢沙门氏菌、伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌[26]。为准确鉴定该菌的种属，对该株分离菌的16S rRNA 基因片段进行了PCR扩增并测序，将测序结果在GenBank上进行比对，结果表明该分离株的16S rRNA序列与鼠伤寒沙门氏菌同源性达100%，鉴定该致病菌为鼠伤寒沙门氏菌。鼠伤寒沙门氏菌主要是通过水平传播[4]，因此，保持鸽场的卫生、设备和饲料的清洁和消毒种蛋，切断传播途径对于该病的防治具有重要意义。

在鸽源沙门氏菌病中，凌育乐等[27]认为主要病原是鼠伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌哥本哈根变种，后者更为多见[28-29]。但也有学者报道在鸽子中分离到的203株沙门氏菌中，鼠伤寒沙门氏菌就占有90.6%[30]，本试验分离到的菌株也为鼠伤寒沙门氏菌，所以流行性可能与不同时间和地区相关。药敏试验结果表明，该致病菌对氨苄西林、阿莫西林、美罗培南等几种药物有较高的敏感性, 在谢冠东等[9]的报道中，曾在鸽肉中分离得到对氨苄西林表现耐药的的鼠伤寒沙门氏菌，但对环丙沙星表现敏感，说明沙门氏菌在的耐药性在不同环境或者养殖场中很可能具有很大的差异，因此在养殖生产中，必须测定细菌对抗菌药物的敏感性，以此为选择具有疗效的药物提供依据，才能迅速达到控制病情的目的，提高存活率，增加经济效益。这对禽病防治减少药物浪费具有重要意义[31]。动物回归试验组中，用其对10日龄鸽进行人工感染，各攻毒方法均引起鸽子死亡。李雪雁等[21]对华南地区分离株进行动物试验发现分离株对雏鸽的发病率100%，而病死率仅为17%，表明此次分离到的致病菌具有较强的毒性，同时可导致与送检鸽子出现相似症状和剖检结果，且不同攻毒组均可以分离到纯净的该菌株，表明该分离菌株可以通过本体动物复制得到原有特征性剖检病变。确定此次分离到的鼠伤寒沙门氏菌具有致病力。在肉鸽的养殖过程中，加强对沙门氏菌的监测和防治是保障肉鸽产业健康发展的重要环节。此次分离到的致病性较强的菌株说明在鸽场沙门氏菌有适宜的传播传代环境，需要鸽场加强饲养管理，做好消毒工作。