羧甲基化木聚糖的益生元作用研究

李霞，陈海鸥，韩淑芳，陆凤莹，周玉恒，单杨，李静*

1(桂林理工大学 化学与生物工程学院，广西 桂林，541006)2(广西植物研究所，广西 桂林，541006)3(湖南农科院农产品加工研究所，湖南 长沙，410125)

益生元是一种不易被人体消化，可改善宿主健康的有机物质，其能够作为肠道菌群的发酵底物并选择性刺激肠道内菌群的生长活动[1]。益生元可以刺激肠道物质运输，增强对矿物质的吸收[2]；也可改变肠道菌群结构，选择性刺激肠道中有益菌，从而产生有益活动，如防御病原菌、改善肠炎等[3-5]；益生元经过益生菌发酵利用，产生的发酵产物如短链脂肪酸，可增强宿主免疫[6]。此外，益生元也可通过其他间接性途径发挥生物活性，如调理心血管疾病等[7]。

木聚糖(xylan，XY)主要来自于植物细胞壁中，是一种具有发展潜力的益生元。但木聚糖的分子质量较大，溶解度较低，功能性基团较少[8]，目前主要是将其加工降解成低聚木糖或低聚果糖等[9-10]。研究表明，对木聚糖结构进行修饰，能够提高其溶解性、表面活性及生物活性等[11]。羧甲基化是最广泛和最常见的修饰方法之一，李和平等[12]制备的羧甲基蔗渣木聚糖热稳定性明显提高，且具有一定的表面活性；KONOURI等[13]探究发现对麦麸阿拉伯木聚糖的羧甲基化改性后，其理化性质发生显著的变化。然而，有关羧甲基化木聚糖的益生元作用的研究鲜有报道。本试验以木聚糖为原料，探索羧甲基化木聚糖(carboxymethyl xylan, CXY)对4种益生菌生长的益生元作用，对于充分利用农业食品废渣和改善环境具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

XY，广西植物研究所；柠檬酸氢二铵、MnSO4、乙酸钠、2,7-二羟基萘等试剂均为国产分析纯；低聚果糖(fructo digosaccharide，FOS)、牛肉浸粉、吐温-80等试剂均为国内生物试剂。

1.2 仪器与设备

ALPHA1-2 LD型冷冻干燥机，德国Martin Christ 公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；LRH-250-Z型振荡培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司；IS10型傅立叶红外光谱仪，美国Thermo Fisher公司。

1.3 实验菌株

短乳杆菌GIM1.773(Lactobacillusbrevis)、植物乳杆菌GIM1.191(Lactobacillusplantarum)、德氏乳杆菌保加利亚亚种GIM1.155[Lactobacillusdelbrueckii(sub sp.)bulgaricus]、嗜热链球菌GIM1.540(Streptococcusthermophilus)，实验室保存菌种。

1.4 培养基

1.4.1 基础培养基

德氏乳杆菌保加利亚亚种、植物乳杆菌、短乳杆菌的基础培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉浸粉10.0 g，酵母浸粉5.0 g，柠檬酸二胺2.0 g，K2HPO42.0 g，MnSO40.05 g，MgSO40.30 g，吐温-80 1.0 mL，葡萄糖 15.0 g，乙酸钠5.0 g，加热溶解后补加蒸馏水至1 000 mL，pH=6.5，121 ℃灭菌20 min。

嗜热链球菌的基础培养基：蛋白胨5.0 g，酵母浸粉10.0 g，CaCO31.0 g，KHPO42.0 g，葡萄糖15.0 g，L-半胱氨酸0.50 g，吐温-80 1 mL，加热溶解后补加蒸馏水至1 000 mL，调节pH=7.0，121 ℃灭菌20 min。

1.4.2 试验培养基

分别以CXY、XY和FOS作为唯一碳源，取代基础培养基中的葡萄糖，其他营养成分同基础培养基。

1.5 实验方法

1.5.1 CXY的制备

采用NaOH-氯乙酸化学法[14]。称取6.0 g XY，溶于100 mL异丙醇和50 mL的200 g/L NaOH溶液中，冰水浴下搅拌3 h。将30.0 g氯乙酸溶于100 mL异丙醇中，与50 mL的200 g/L NaOH溶液相混合，得到混合溶液。将混合溶液缓慢滴入反应体系中，在60 ℃下搅拌4 h，停止反应，冷却至室温。用1 mol/L的HCl中和，流水透析24 h。浓缩，冷冻干燥，得到CXY。

1.5.2 红外光谱测定

取1.0 mg干燥后的样品，与100.0 mg的KBr 参照物混合，研磨，压片，在4 000～400 cm-1用红外光谱仪进行红外光谱扫描，得到红外光谱扫描图。

1.5.3 取代度的测定

用二次水配制0.4 mg/mL的CXY溶液，取0.25 mL 0.4 mg/mL的CXY溶液与0.25 mL 浓H2SO4混匀，125 ℃下加热3 h，再将2 mL 2,7-二羟基萘溶液(0.1 mg/mL)加入到混合液中，充分混匀，沸水浴20 min后停止反应，冷却至室温，最后加入2 mL 蒸馏水，以蒸馏水为对照，测定其在520 nm 处吸收值，平行测定3组[15]。用在CaCl2中干燥过夜的乙醇酸替代多糖样品，制作标准曲线，计算1 g多糖样品中乙醇酸的质量，记为A，CXY取代度计算如公式(1)所示：

(1)

1.5.4 消化性研究

1.5.4.1 模拟唾液消化的测定

模拟唾液(A)：0.764 g NaCl、1.491 g KCl、0.133 g CaCl2用蒸馏水定容至1 000 mL，用1 mol/L的NaHCO3将pH调至6.9。称取α-淀粉酶0.345 g加入400 mL A中溶解，磁力搅拌20 min后过滤，滤液中再加入400 mL的A溶液混匀。分别配制1 mg/mL CXY、XY和FOS溶液，按照V(多糖溶液)∶V(模拟唾液)=1∶1添加唾液，放于37 ℃的恒温振荡器中反应，以模仿口腔环境。在0和0.5 h时收集样品，煮沸5 min以灭活酶。还原糖的测定采用二硝基水杨酸方法，总糖含量的测定采用苯酚-H2SO4法。水解度计算如公式(2)所示：

(2)

式中:水解的还原糖为某时间点取样测得的还原糖含量与最初的还原糖含量之差，mg。

1.5.4.2 模拟胃液消化的测定

缓冲溶液的配制：分别称Na2HPO4·H2O 8.25 g；NaH2PO414.35 g；NaCl 8.00 g；KCl 0.20 g；CaCl2·2H2O 0.10 g； MgCl2·6H2O 0.18 g，用蒸馏水溶解后定容至1 000 mL。再用1 mol/L HCl溶液将缓冲液的pH值分别调至1、 2、 3。分别称取100 mg CXY、XY和FOS添加到10.0 mL上述缓冲溶液中，37 ℃水浴6 h。在反应4 h和6 h时，各取1.0 mL样品溶液测定其中还原糖和总糖的含量。根据公式(2)计算水解度。

1.5.4.3 模拟小肠液消化的测定

模拟小肠液(B)：分别称取5.40 g NaCl，0.65 g KCl和0.33 g CaCl2，用蒸馏水溶解后定容1 000 mL。将13 mg胰蛋白酶，100 mL胰酶溶液(质量分数7%)和200 mL胆汁盐(质量分数4%)与100 mL B液混合，并通过1 mol/L的NaHCO3调节至pH值为7。分别配制1 mg/mL CXY、XY和FOS溶液，按照V(多糖溶液)∶V(模拟小肠液)=1∶1添加模拟小肠液，在反应4 h和6 h，各取1.0 mL样品溶液煮沸5 min以灭活酶，然后测定其中还原糖和总糖的含量。根据公式(2)计算水解度。

1.5.5 对4种益生菌增殖的影响

根据1.4.2，配制质量浓度分别为5、10、15、20、30 g/L的CXY、XY和FOS培养基，再分别接入100 μL充分活化的菌种，在37 ℃培养48 h，取样测定各培养液在600 nm的OD值和培养基的pH值。

根据1.4.2，配制CXY、XY和FOS质量浓度为30 g/L的培养基，接入1%充分活化的菌种悬液，在 37 ℃培养48 h。以培养时间为横坐标，OD600 nm为纵坐标，绘制4种菌的生长曲线。

1.6 数据分析

试验结果均表示为平均值±标准差(X±SD)，采用SPSS 17.0软件进行分析，使用Origin 17.0软件画图。

2 结果与分析

2.1 CXY的红外光谱

CXY的取代度测定结果显示，其标准曲线的回归方程为y=16.256x+0.002 5，R2=0.993 6，计算得到取代度为0.68。

图1 多糖的红外光谱图

2.2 CXY对抗消化性的影响

人体消化酶对碳水化合物的水解主要针对其中的α-糖苷键[17]，红外图谱表明CXY中主要含有的是β-D糖苷键构型的木聚糖分子骨架，且在模拟唾液消化试验中(表1)，0.5 h后XY、CXY和FOS的水解度分别为8.49%、8.86%和5.25%，说明CXY能较好地抵抗模拟唾液的消化。

正常情况下，人体胃酸pH值为1～3，食物进入胃后停留时间为4～6 h[17-18]。多糖抵抗胃酸的水解到达大肠才能发挥益生元等作用。因此本试验采用不同pH值的模拟胃液对XY、CXY和FOS进行水解，分析CXY作为益生元的可能性。如表1所示，在水解4 h后，pH值为1的模拟胃液中，XY、CXY和FOS的水解度达到最大值，分别为2.00%，1.49%和2.98%。在水解6 h后，pH值为1的模拟胃液中，XY、CXY和FOS的水解度达到最大值，分别为4.07%，4.16%和3.19%。CXY在模拟胃液中的水解度<5%，表明CXY在胃中有较好的稳定性，可抵抗胃液消化。试验结果与绍兴黄酒多糖[18]以及霍山石斛多糖[19]的抗消化性研究结果一致。

在模拟小肠液消化试验中，在水解4 h后，XY、CXY和FOS的水解度分为3.15%、0.88%和1.35%。在水解6 h后，XY、CXY和FOS的水解度分为3.56%、5.82%和2.82%。CXY在模拟小肠液中的水解度<6%，表明CXY能够抵抗小肠液消化。以上结果表明，CXY可以较好的抵抗人体消化道消化。

表1 CXY的溶解性和在模拟唾液、胃液和小肠液中的水解度 单位：%

2.3 CXY对益生菌生长的影响

2.3.1 不同浓度CXY对益生菌生长的影响

多糖对益生菌的生长情况如图2-a～图2-d所示，CXY对4种菌的生长均有一定的促进作用。图2-a中，以短乳杆菌为例，在不同碳源的培养基中，CXY的增殖效果显著大于XY组(P<0.05)，且在多糖质量浓度为30 g/L时增殖效果最佳。图2-b～图2-d中，CXY多糖质量浓度为30 g/L时对植物乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的增殖效果极其显著(P<0.01)。分析原因可能是溶解性的影响，CXY的溶解性优于XY，溶解度高的多糖更有利于益生菌消化利用，促进益生菌增殖[17]。已有研究表明多糖的水溶性和生物活性随着羧甲基取代度的增加而增大，而多糖在水中的溶解度会影响其益生元效果[20-21]。

益生菌的生长会引起菌液pH值的变化，通过测定液体培养基的pH值，可直观地观察出不同菌种的生长情况。如图2-e～图2-h所示，随着多糖浓度的增加，所有组的pH值均呈现下降趋势。在质量浓度为3%时到达最小值，且pH<4.9，其中短乳杆菌组菌液pH值最低，为4.23。CXY对短乳杆菌和植物乳杆菌的产酸影响较明显，CXY质量浓度为5～20 g/L时，两者pH值差异显著(P<0.05)。德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的pH均有下降，但下降趋势不明显。结果表明CXY能够被4种实验益生菌利用，产生酸性代谢产物。

2.3.2 CXY对益生菌生长曲线的影响

如图3所示，CXY对4种益生菌的生长均有促进增殖作用。短乳杆菌和嗜热链球菌在CXY为唯一碳源的培养基中，培养36 h后达到最大生长量，继续培养，OD值基本保持稳定。植物乳杆菌在分别添加FOS、CXY和XY作为唯一碳源的培养基中，均在24 h后达到最大生长量，OD值分别为1.735、1.688和1.595。在CXY试验培养基中，德氏乳杆菌保加利亚亚种在培养24 h后，OD值达到最大值(1.632)，而在XY试验培养基中，48 h后达到最大生长量。在相同浓度下，CXY对4种益生菌生长曲线的影响与FOS的作用相似，表明CXY有良好的促进肠道益生菌增殖潜力，可作为一种潜在的益生元。

CXY对益生菌的促进作用优于XY，但没有FOS作用效果显著，我们推测可能有以下几种原因：(1)一般而言，分子质量小的多糖聚合度较低，易被益生菌分解和利用，从而发挥益生元效果[22]，所以低聚合度的FOS对4种益生菌的增殖效果优于XY和CXY。(2)XY在修饰改性的过程中，可能发生一定的降解导致其分子质量和聚合度降低[13,23]，所以羧甲基化修饰后的XY对益生菌的增殖优于XY。(3)羧甲基化修饰后的多糖溶解度增大，能够更好的发挥功能活性[24]，因此CXY的溶解度大于XY，更易被益生菌吸收、利用和代谢。多糖对益生菌的益生元效果是由多方面因素决定的，除聚合度、分子质量和溶解度外，多糖的单糖组成、结构复杂性，以及成分纯度等都会影响其益生元效果[25-26]。

3 结论

通过NaOH-氯乙酸化学法制备得到CXY，对比研究CXY对4种益生菌的增殖效果以确定其作为益生元的潜力。试验结果表明，红外光谱图分析表明木聚糖羧甲基化修饰成功，CXY可以抵抗人体消化道的水解，能够进入肠道被4种实验益生菌利用，在质量浓度为30 g/L时，增殖效果达到最佳。CXY对4种益生菌的促进作用稍弱于FOS，但优于XY，且作用显著。CXY对不同益生菌的增殖作用不同，可能是不同益生菌分解利用益生元的能力不同。综上所述CXY是一种潜在的益生元。

a-短乳杆菌；b-植物乳杆菌；c-德氏乳杆菌保加利亚亚种；d-嗜热链球菌