三芪丹对糖尿病兔股动脉狭窄的研究

莫伟，许秀婷，肖志勋，张文智，林奕霞，周晖，汪何

下肢动脉粥样硬化性病变（lower extremity arterial disease，LEAD）是糖尿病常见而严重的并发症，其发病率逐年上升，据流行病学调查结果显示，LEAD 的总体流行率为21.2%［1］。LEAD 若不能及时治疗，则会成为导致患者致残和死亡的重要原因，对其生命和生活质量带来极大威胁［2-3］。近年来随着介入技术与材料的迅速发展，介入治疗显然已成为LEAD 的主要干预措施。但术后再狭窄仍是当今重大难题，源于介入术引起的机械性物理损伤会导致血管内膜受损增生，加之血管弹性回缩，从而易致血管重塑而出现再狭窄再闭塞［4］。但研究发现，在中医药的辅助下，对于LEAD 临床治疗效果明显提高，并对糖尿病下肢动脉病变介入术后患者具有明显疗效。

三芪丹颗粒是经多年临床经验总结，广东省第二中医院治疗糖尿病血管病变的常用有效方，由黄芪、桑葚、丹参、三七组成，通过临床观察也证明其能够有效的改善患者的血糖、血脂等，对LEAD 介入后患者血管再狭窄闭塞有着一定的疗效，但其对血管损伤修复的机制尚不明确。故本实验旨在探讨该方对糖尿病兔球囊扩张后再狭窄的改善作用及机制，为相关治疗及预防提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物24 只新西兰大耳白兔，来自广东省实验动物中心，批号：44007200071182，质量约2.2～2.5 kg，实验动物的室温22℃～26℃，相对湿度40%～60%，明暗交替12 h，自由饮水、采食。实验动物的饲养和实验过程遵循广东省第二中医院实验室的动物实验规范。高脂饲料中热量百分比分别为：2%胆固醇、0.5%胆酸和5%猪油，92.5%基础饲料。

1.2 主要试剂与仪器

血糖仪、血糖试纸（辅理善越佳型，Abbott 公司），四氧嘧啶、戊巴比妥钠（Soalrbi 公司）、PTCA 导丝（直径0.014 英寸）、普通PTCA 球囊导管（1.5 mm×20 mm，Abbott公司）和压力泵（北京迪玛克医药科技有限公司）。TG、TC、HDL-C、LDL-C 测定试剂盒（规格：96T，南京建成品牌，批号：202006）。兔Glu ELISA 试剂盒（批号：731200622），兔hs-CRP ELISA试剂盒（批号：336200622），兔IL-6 ELISA 试剂盒（批号：385200622），兔TNF-a ELISA 试剂盒（批号：569200622），兔ET ELISA试剂盒（批号：260220622），ELISA 试剂盒均为规格：48tests，ANRC 品牌。

1.3 药物选择及溶液制备

三芪丹颗粒由黄芪、桑葚、丹参、三七组成，均购于广东省第二中医院，根据兔子体重称取相应的剂量颗粒（750 mg/kg·d），并将颗粒溶于400 mL的热水中，充分溶解，待逐渐冷却至常温，分两次喂食兔子，直至喝完。

1.4 分组及给药

20 只兔子适应性喂养1 周后，将兔随机分为空白组（4 只）、对照组（8 只）和中药组（8 只）；空白组不做任何处理，并予普通饲料喂养；对照组和中药组采用四氧嘧啶静脉注射建立糖尿病兔模型，糖尿病建模成功后均予高脂喂养，两个组均接受了球囊扩张股动脉术。造模完成后对照组予清水喂食，中药组予三芪丹颗粒溶液（750 mg/kg·d）喂食。术后4 周处死取样。

1.5 糖尿病股动脉损伤模型的建立

1.5.1 糖尿病兔模型建立 所有兔子均于SPF 级动物实验室内普通饲料适应性喂养1 周，1 周后耳缘静脉测禁食血糖（FBG）。将浓度为120 mg/mL的四氧嘧啶溶液自按1 mL/kg 静脉注射入对照组和模型组兔子的耳缘静脉，注射3 天后测空腹血糖，凡血糖≥13.5 mol/L 为糖尿病模型形成，血糖并将持续增高至处死前。若血糖不达标者一周后追加四氧嘧啶80 mg/（kg·bw），追加后72 h 测FBG，若仍不达标者一周后再次追加，直至FBG 达标。由于四氧嘧啶会破坏大量的胰腺β 细胞，导致短时间内释放大量胰岛素导致兔子低血糖死亡，从而用药后36 h 均予以自由饮用5%的葡萄糖水以助其渡过最初的严重代谢失衡阶段，从而减少兔子死亡风险。对于血糖＞33 mmol/L 的兔子均予每日1 次皮下注射2 U 重组人胰岛素，直至血糖＜33 mmol/L。

1.5.2 股动脉血管狭窄模型建立 取出建立糖尿病模型成功后的模型组兔子，将戊巴比妥钠用生理盐水配成溶液，并以40 mg/kg 的剂量于耳缘静脉注射进行麻醉，约2～3 min 后兔子意识丧失，四肢肌肉松软，麻醉成功，若兔子仍有挣扎则进行少剂量补打，并持续监测兔子呼吸及心跳。麻醉成功后将兔的四肢及头部固定于兔固定器，并予备皮，常规消毒铺巾。无菌条件下，在股动脉搏动最明显处，沿股动脉走行方向切开皮肤及皮下组织，钝性分离股总、股深、股浅动脉。于股深动脉血管壁逆行穿刺，引入导丝，逆行插入球囊导管至股总动脉水平，插入深度为2～5 cm，应用压力泵（压力为～6 atm）扩张球囊，回拉球囊约1 cm 左右，将球囊送至原位，反复4～5 次，确保股总动脉内膜拉伤。自股深动脉退出球囊导丝后，股深动脉结扎止血，依次缝合切口，再用庆大霉素注射液冲洗伤口以预防感染，最后用纱布包扎伤口。术后连续3 天每天伤口予涂红霉素软膏并纱块包扎以保持伤口洁净。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计分析软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，各时间点之间均数的比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA）。

2 结 果

2.1 糖尿病兔模型建立的效果

16只兔参与建模，成功率87.5%。给与四氧嘧啶药剂后兔子出现精神懒散，动作迟钝，其中2 只第2 天出现低血糖现象，精神萎靡，四肢无力，拒绝进食进水，测血糖血糖仪显示为low（血糖值低至测不出），予10%葡萄糖耳缘静脉注射20 mL 后兔子状态逐渐恢复，并可以主动进食进水，2 h 后复测血糖分别为5.2 mmol/L 及7.5 mmol/L，之后所有对照组及模型组的兔子药物静脉注射3d 后血糖大于13.5 mmol/L，有的出现多饮、多食、多尿症状。股动脉血管狭窄模型制作时给予戊巴比妥钠麻醉时有1 只体重较轻的兔子出现心脏、呼吸骤停而死亡，另有1 只兔子在造模完成后2 天后出现不明原因死亡。其他股动脉球囊拉伤的兔子精神和饮食状况皆可。给药后4 周各组体重及血糖变化：进入实验前，组兔子的体重及血糖均无明显差异（P＞0.05），实验结束后，空白组的体重较前显著上升，对比造模组有统计学差异（P＜0.05）。

2.2 实验兔病理形态学观察

模型组家兔动脉表面形态凹凸不平，边缘不齐，血管颜色呈淡黄色，弹性最差，血管中间区域可见明显增粗区域，管腔内膜有明显大小不等的突起于内膜表面的黄白色脂质条纹及隆起脂质斑块形成；解剖可见肝脏为明显的脂肪肝改变（如图1a）；兔子眼睛晶状体出现浑浊（如图1b）。HE病理提示：空白组血管未见异常（如图1d），油红染色提示阴性；中药组病理显示所示：动脉内壁环状增厚，有泡沫细胞小灶性聚集（如图1e）；对照组显示动脉粥样化病变，镜下可见粥样斑块，内膜、中膜有大量泡沫细胞及脂质沉积，约75%血管管腔堵塞（如图1f），油红染色提示阳性（如图1c）。

2.3 三芪丹颗粒对对血糖、血脂指标的影响

与空白组相比，对照组FBG、TC、TG、LDL-C 含有量均显著升高（P＜0.01），HDL-C 含有量显著降低（P＜0.01）。与对照组相比，中药组FBG、TG、LDL-C均有降低（P＜0.05），HDL-C 含有量升高（P＜0.05）。具体见表1。

2.4 三芪丹颗粒对炎症相关因子的影响

图1 实验兔病理形态学观察

表1 三芪丹颗粒对对血糖、血脂指标的影响（±s，mmol/L）

表1 三芪丹颗粒对对血糖、血脂指标的影响（±s，mmol/L）

组别空白组对照组中药组n 4 7 7 FBG 5.85±0.75 19.03±0.47 18.24±0.62 TC 7.03±0.74 14.14±0.72 13.11±1.07 TG 1.48±0.45 8.40±0.57 7.5±0.79 LDL-C 1.30±0.25 4.24±0.35 3.59±0.63 HDL-C 3.54±0.41 1.63±0.29 2.02±0.28

与空白组比较，对照组hs-CRP、IL-6、TNF-α、ET 含有量均显著升高（P＜0.01）。与对照组比较，中药组hs-CRP、IL-6、TNF-α、ET 含有量降低（P＜0.05），具体见表2。

表2 三芪丹颗粒对炎症相关因子的影响（x±s）

3 讨 论

近年来，血管内球囊扩张术治疗因其创伤小、可迅速改善症状、不需要开放性手术等优点成为治疗糖尿病下肢动脉狭窄的主要治疗手段［5］，然而术后内膜自愈可引发再狭窄，且术后狭窄率高达30%［6］。血管弹性回缩、血栓形成、炎症因子的过度表达、血管平滑肌增殖等被认为是导致血管内膜损伤后病理性重构的关键环节［7］。其中，炎症反应及血管平滑肌过度增殖在其发病过程中起着极其重要的作用。hs-CRP、ET、IL-6、TNF-a 等炎症因子的增加可引起局部炎症反应从而导致内皮细胞功能障碍，导致球囊扩张后血管内膜过度修复，最终形成血管狭窄［8，9］。与此同时，血管平滑肌细胞过度增殖导致的内膜增生也被认为是血管病理性重构的主要细胞学因素［10，11］。因此，抑制炎性细胞因子和平滑肌过度增殖是改善球囊扩张术后再狭窄的一种新的治疗方法［12］。

我院汪何教授结合中医基础理论及临床多年经验，认为糖尿病患者多病程长、才易并发血管病变，故其发病机制多为气阴两虚，瘀血阻络的虚实夹杂之证。因此补气养阴、活血通络是治疗糖尿病下肢病变的关键，通过中医辨证施治，从整体上改善局部微循环，起到缓解疼痛、预防介入后再闭塞的作用。由此思想为基础，汪何教授创制三芪丹颗粒应用于临床，有着良好的临床疗效。方中黄芪为君药，既是补气生血要药，又能活血，对气虚血瘀者能标本兼治；三七为臣药，具有活血化瘀，散瘀止血之功效；桑葚能滋阴润燥，丹参能活血化瘀，排脓止痛，具与为佐药。诸药合用，具有益气养阴，活血化瘀功效。因此该方用于2 型糖尿病下肢血管病变治疗时可与血管介入球囊扩张方式联合应用，则可发挥协同作用，在减轻球囊扩张后再狭窄的同时可以改善临床不良症状。

本次的实验研究表明，三芪丹颗粒能有效地改善血糖、血脂等相关指标和Y 抑制炎症因子的生成，同时减轻了因球囊扩张造成的内膜增殖和管腔狭窄，逆转了球囊扩张引起的股动脉组织的病理性损害，从而改善血管介入球囊扩张后再狭窄的生理状态。综上所述，表明该方对糖尿病有一定治疗作用，并可以通过抑制炎症反应的发生并减少糖脂代谢紊乱，同时抑制血管内膜的过度增生，最终达到改善糖尿病下肢动脉球囊扩张术后再狭窄的发生率。