长链非编码RNA loc728196促进胶质瘤发生的调控机制

王欧洋

神经胶质瘤起源于中枢神经体系，发病率高，占原发性脑肿瘤35.26%～60.96%［1］，病理上多呈浸润性生长，手术难度大，较难分辨出真正的肿瘤边界，放疗辐射耐受程度可能会引起残余病灶复发。长链非编码RNA（long non coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度＞200核苷酸的RNA，本身无蛋白质编码能力，近年来国内外研究表明，lncRNA参与中枢神经系统的表达，已有研究表明lncRNA在胶质瘤中存在异常表达［2］；lncRNA UCA1促进胶质瘤的生长，且可通过靶向miR-122发生转移［3］。lncRNA CCAT1在抑制细胞凋亡的同时抑制miR-410，促进胶质瘤细胞的增殖。lncRNA SNHG1通过调节、迁移和凋亡促进胶质瘤的发展，可评估预后程度［4］。lncRNA TP73-AS1与miR-142相互作用，促进胶质瘤细胞的增殖。loc728196是一种新型lncRNA，但目前国内外尚无关于lncRNA loc728196与人脑胶质瘤的相关性研究。因此，本研究将实验证明lncRNA loc728196/miR-513c轴通过靶向TCF7促进胶质瘤的发生。

1 材料与方法

1.1 细胞系及细胞培养 四种胶质瘤细胞系（U87、U251、LN229和A172）和人星形胶质细胞系（NHA）购自美国ATCC（American Type Culture Collection）。细胞培养在含有10%FBS的DMEM培养基中，且在37℃和5% CO2条件下培养。

1.2 细胞转染 小干扰RNA（si-LOC728196；5"-G AGACU AUAUUGUUAGUAAUA-3"）和短发夹状RNA （shRNA；5"-GAGACTATATTGTTAGTAATA-3"）由Invitrogen合成纯化。MiR-513c模拟物（5"-UUCUCAAGGAGGUGUCGUUUAU-3"），MiR-513c抑制剂（5"-AUAAACGACACCUCCUUGAGAA-3"）和阴性对照组（miR-NC；5"-UCACAACCUCCUAGAAA GAGUAGA-3"）均购于 GenePharma公司（Shanghai，China）。参照转染试剂 Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA） 的 说 明 书 步 骤， 将100nM siRNAs、miRNAs转染至细胞系中。在病毒生产方面，将sh-LOC728196序列克隆到pHBLV-U6慢病毒核心载体中（Hanbio，Shanghai，China）。

1.3 细胞增殖实验 2×103U251和A172细胞置于96孔板中培养24h、48h或72h。然后将CCK-8溶液（Beyotime，Shanghai，China） 加 入 细 胞 4h， 然后CCK-8法450nm波长处测定每组细胞吸光度值。1×103U251和A172细胞接种至6孔板的每一口中，孵育14d后，菌落用甲醛固定，用0.5%结晶紫（Sigma，USA）染色，然后用显微镜计数。

1.4 Transwell细胞迁移、侵袭实验 细胞迁移实验：将细胞组常规消化后，加入无血清的DMEM培养基制备1×108/L的细胞悬液。于24孔板Transwell小室上室中加入200μl细胞悬液，下室中加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基。每组实验重复3次。置于培养箱内常规培养48h后，取出小室，分别加入10%甲醇和0.1%结晶紫溶液固定、染色，晾干后，于倒置显微镜下观察、拍照。各组细胞迁移能力以随机选取的6个视野的细胞数的平均值表示。细胞侵袭实验：实验前，以浓度为1g/L的Matrigel对Transwell小室上室聚碳酸酯微孔膜进行包被，于培养箱内聚合反应30min后，在小室上室中加入细胞悬液，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养48h，取出小室，以甲醇和结晶紫对细胞进行固定和染色，倒置显微镜下拍照分析。详细步骤参照迁移实验。

1.5 qRT-PCR法 检 测lncRNA-LOC728196、MiR-513c及TCF-mRNA表达 按照Trizol试剂盒步骤提取组织总RNA，以β-actin为内参，qRT-PCR按照SYBR-Green试剂盒说明进行反应体系的配置，通过PrimeScriptTMRT试剂盒检测RNA浓度，反转录试剂盒合成cDNA。将逆转录的产物稀释后，加相应RNA的引物，用SYBR Green Kit法进行扩增反应。以U6为内参，采用2-△△ct法计算目的基因的相对表达。

1.6 Western-blot法检测TCF7蛋白表达 收集转染48h后的各组细胞，加蛋白酶抑制剂裂解，4℃以下以12000r/min离心30min，取上清液，根据BCA蛋白定量检测试剂盒操作要求测定总蛋白浓度。各组加入12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜；含5%脱脂牛奶的封闭液室温下封闭1h，转膜，加一抗，4℃过夜，加入二抗，室温下孵育30min；洗模后显影曝光。使用GAPDH为内参，ImageJ分析条带灰度值。

1.7 统计分析 采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以表示，组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 lnc RNA -loc728196在胶质瘤组织中存在高表达 实验比较四种胶质瘤细胞系（U87、U251、LN229和A172）和人星形胶质细胞系（NHA）中lncRNA-loc728196基因表达差异，结果显示胶质瘤细胞系中lncRNA-loc728196表达水平显著高于正常胶质细胞系（见图1）。结果表明lncRNA-loc728196与胶质瘤疾病的发生有密切相关性。

图1 四种胶质瘤细胞系（U87、U251、LN229和A172）和NHA中lncRNA- loc728196基因表达比较（⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01）

2.2 loc728196影响胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭 对于loc728196的功能研究，作者进行了细胞增殖、迁移、侵袭实验，首先设计了两个针对loc728196抑制其表达的siRNA序列。qRT-PCR分析显示，转染两种siRNA均可显著抑制U251和A172细胞中loc728196的表达（见图 2A）。然后，利用siRNA #1进行以下实验。CCK8结果表明，沉默loc728196可降低U251和A172细胞的增殖率（见图2B、C）。此外，克隆形成实验还显示，沉默loc728196可减少克隆数（见图2D），表明loc728196能促进胶质瘤细胞的增殖。细胞迁移和侵袭实验表明，沉默loc728196可抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭（见图2E、F）。

图2 U251、A172细胞株转染不同干扰质粒后loc728196基因表达及细胞功能变化（⋆P＜ 0.05，⋆⋆P＜0.01，⋆⋆⋆P＜0.001）

2.3 胶质瘤细胞中loc728196与 miR-513c的相互调节作用 在前期的生物信息学分析中，发现loc728196与miR-513c之间存在2个潜在结合位点（见图3A）。基于此，作者在细胞系中转染miR-513c模拟剂，结果显示loc728196-WT#1和loc728196-WT#2的荧光素酶活性均被明显抑制（见图3B），表明转染miR-513c可抑制loc728196表达水平。为了更进一步证明loc728196和miR-513c之间的调节关系，U251和A172细胞系通过慢病毒包装转染敲除loc728196，发现miR-513c表达水平较前提高（见图3C）；在细胞中转染miR-513c后，loc728196表达水平下降（见图3D）。

2.4 LOC728196通过miR-513c调控TCF7表达 前期生物信息学分析中，作者已经发现miR-513c与TCF7 mRNA结合的2个潜在位点（见图4A）。荧光素酶实验结果也证明了miR-513c可结合在 TCF7 mRNA的3 "-UTR区域的两个位点（见图4B）。U251和A172细胞中转染miR-513c后，TCF7蛋白水平和mRNA水平均下降（见图4C、D）；同时转染miR-513c和loc728196-WT的细胞组TCF7 mRNA水平较转染miR-513c细胞组明显升高（见图4F）。在U251和A172细胞中转染si-loc728196，TCF7 mRNA水平下降；而同时转染si-loc728196和miR-513c抑制剂的细胞组TCF7 mRNA水平明显高于仅转染si-loc728196细胞组（见图4E）。以上结果表明loc728196可通过抑制miR-513c发挥促进TCF7表达的作用。

图3 loc728196与miR-513c的荧光素酶活性结果及miR-513c对loc728196的负调控作用（⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01，⋆⋆⋆P＜0.001）

图4 TCF7与miR-513c的荧光素酶活性结果及miR-513c、loc728196对TCF7的调节作用（⋆P＜0.05，⋆⋆P＜0.01，⋆⋆⋆P＜0.001）

3 讨论

lncRNA很多功能尚未完全明确［5］，但随着基因组技术的发展，越来越多的证据表明lncRNA通过调控靶基因表达，参与多方面的细胞生物功能，包括转录的激活、转录后调控等［6］。lnc RNA很可能影响促癌基因或抑癌基因的功能，从而促进或者抑制肿瘤的形成［7］。近年来国内外研究表明，lncRNA HNRNPKP2在胃癌中表达上调，其通过CXCR4的表达促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［8］；也有研究表明，lncRNA SNHG1作为一种ce RNA 抑制miR-199a-3p活性，刺激CDK7的表达，因此促进前列腺癌细胞的增殖和细胞周期的发展［9］；此外，lncRNA MALAT1通过调节miR-125b在口腔鳞状细胞癌中发挥癌基因的作用［10］；lncRNA HOXD-AS1通过作为 ceRNA 上调 SOX4水平促进肝癌转移。不仅如此，现有研究表明越来越多lncRNA参与中枢神经系统的表达，国内外研究也证明lncRNA在胶质瘤中存在异常表达［11］。已有研究表明，lncRNA UCA1促进胶质瘤的生长，且可通过靶向 miR-122发生转移［12］；lncRNA CCAT1在抑制细胞凋亡的同时抑制miR-410，促进胶质瘤细胞的增殖［13］；lncRNA SNHG1通过调节、迁移和凋亡促进胶质瘤的发展，可评估预后程度［14］；lncRNA TP73-AS1与miR-142相互作用，促进胶质瘤细胞的增殖［15］；lncRNA MALAT1可增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的耐药性［16］。此外，lncRNA CRNDE 可作为评估胶质瘤预后的生物标记物［17］。以上诸多研究均表明lncRNA可能在胶质瘤生长及凋亡等过程中起到关键调控作用。本研究表明沉默loc728196可抑制胶质瘤细胞的生长，提示lncRNA loc728196可能与胶质瘤细胞生长和凋亡密切相关；同时作者也发现loc728196可能作为一个ceRNA 调节miR-513c的表达，而TCF7可能是miR-513c的直接靶标，且loc728196和miR-513c之间存在相互抑制关系，loc728196通过调节miR-513c促进TCF7表达，因此，作者推测lncRNA loc728196可能通过miR-513c/TCF7途径来参与对胶质瘤的生长及凋亡的调控。本研究通过研究胶质瘤恶性生物学行为密切相关的分子生物学靶点，寻求一种新的生物学标志物，及早发现及阻断胶质瘤的生长和增殖，从新的角度揭示lncRNA loc728196可能通过miR-513c/TCF7途径调控胶质瘤的生长及凋亡，为胶质瘤患者的治疗及预后评估提供了新的治疗靶点。