白介素-38在活动期系统性红斑狼疮患者中的 表达及与IKKβ激酶的关系

张继云, 赵旌, 努尔夏提·塔布什, 罗莉

(新疆医科大学 第一附属医院 风湿免疫科， 乌鲁木齐 830054; 新疆医科大学 第二附属医院 风湿免疫科， 乌鲁木齐 830063)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种病因尚不明确，可以侵犯全身多系统的慢性弥漫性结缔组织病，体内出现多种自身抗体，使机体免疫系统攻击自身组织，引起全身多脏器和组织损伤.SLE免疫调节异常的表现极其复杂，包括自身反应性淋巴细胞耐受异常、凋亡异常、细胞因子分泌及其受体表达异常以及对激活信号内源性反应增高等[1-2].IκB激酶复合物 (IκB- kinase complex，IKK)是核因子KappaB (nuclear factor-κB, NF-κB)活化中不可或缺的关键酶，是一个蛋白激酶复合体，主要由IKKα、IKKβ、IKKγ组成，其中IKKβ是具有关键作用的激酶.细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1等通过刺激IKK引起IκB磷酸化、泛素化和降解，使活化核因子-κB(NF-κB)转位入核与相应的靶基因结合，调节靶基因的转录和蛋白合成，从而调控大量炎症因子，诱导T细胞的增殖、分化，参与了SLE的发病[3-4].

白介素-38(interleukin-38，IL-38)是白介素-1 家族成员中的一员，目前研究认为是人体中重要的抗炎细胞因子，抑制巨噬细胞分泌如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性细胞因子，同时介导辅助性T细胞17(thelper 17 cell,Th17)细胞所诱导的炎症反应，在免疫和感染相关疾病的发病机制中具有重要的作用[5-8].因此，本研究旨在分析IL-38在活动期SLE患者体内的表达水平，并探索在SLE患者体内IL-38与IKKβ表达水平之间的关系，以揭示SLE内在的免疫学机制，为临床发现新的诊治方案和靶向药物提供方向.

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集新疆医科大学附属第二医院30例SLE住院患者，年龄24～59岁，平均(35±10)岁，其中女性21例，男性9例，诊断均符合1997年美国风湿病学院修订的SLE分类标准，SLEDAI评分大于8分，病情均处于活动期.30例体检中心的健康人群作为正常对照，年龄27～54岁，平均(33±7)岁，其中女性20例，男性10例，均无风湿病史和风湿病家族史.各组间年龄、性别差异均无统计学意义.本研究经院伦理委员会批准(20190512-11)，所有患者知情同意后，获取血液标本.

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂

TNF-α酶联免疫吸附测定试剂盒(江莱生物)；人白细胞介素38酶联免疫吸附测定试剂盒(江莱生物)；Trizol(invitrogen)，DEPC处理水(无锡菩禾)；氯仿/异丙醇/无水乙醇(上海国药)；SYBR Green PCR试剂盒(Thermo F-415XL)，逆转录试剂盒(Thermo #K1622)；全血总RNA快速抽提试剂盒(生工 B518623).

1.2.2 仪器

超净工作台(苏州安泰科技有限公司)；低温冷冻离心机(Sigma 3K15)，Real-time检测仪(ABI-7500)；酶标检测仪 (Thermo MK3 型).

1.3 实验方法

1.3.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)测IL-38、TNF-α蛋白表达水平

收集血清分离管的全血标本于3 000 r/min离心5 min，取上清进行ELISA检测.设置标准品孔、空白孔和样本孔，分别加入待测样本及抗体，温育后静置，重复洗板5次，37 ℃避光孵育后加终止液，测定各孔的吸光度值.

表1 qRT-PCR检测引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.3.2 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测IL-38 mRNA、IKKβ mRNA

按Trizol法提取血液中总RNA，反转录成cDNA.在Real-time检测仪上以cDNA为模版利用DNA聚合酶TaKaRa EX TapTM HS进行实时定量PCR扩增反应，实时荧光定量PCR仪自动分析结果.引物序列见表1.采用2-ΔΔCt法分析目的基因在对照组和各实验组之间的表达差异，计算标准化后2-ΔΔCt值表示mRNA 的相对表达量，即为各组中基因的相对表达量.

1.4 统计学处理

2 实验结果

2.1 活动期SLE组和正常对照组IL-38表达水平的比较

qRT-PCR、ELISA法检测活动期SLE组和正常对照组IL-38表达水平，发现活动期SLE患者IL-38 mRNA表达水平(0.36±0.09)显著低于正常对照组(1.00±0.17)，差异有统计学意义(P<0.01)；活动期SLE患者IL-38蛋白表达水平(5.86±2.76)pg/mL显著低于正常对照组(18.48±1.35)pg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)(图1).

2.2 活动期SLE组和正常对照组TNF-α蛋白表达水平的比较

ELISA法检测结果显示活动期SLE患者TNF-α蛋白表达水平(10.78±1.25)pg/mL明显高于正常对照组(4.34±0.69)pg/mL，差异有统计学意义(P<0.05)；且活动期SLE患者IL-38与TNF-α蛋白表达水平呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05)(图2).

2.3 活动期SLE组和正常对照组IKKβ mRNA表达水平的比较

qRT-PCR结果显示活动期SLE患者IKKβ mRNA表达水平(6.01±1.51)高于正常对照组(1.16±0.14)，差异有统计学意义(P<0.01)；且活动期SLE患者IL-38与IKKβ mRNA表达水平呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05)(图3).

与对照组比较：1)P<0.01；2)P<0.05Compared with control group: 1)P<0.01；2)P<0.05

1)与对照组比较，P<0.051)Compared with control group，P<0.05

1)与对照组比较，P<0.011)Compared with control group，P<0.01

3 讨论

白介素-1家族细胞因子普遍存在机体炎性细胞内，在机体的免疫调节过程中发挥着重要作用[9].IL-38曾被命名为IL-1F10、IL-1HY2[10]，是近年来新发现的细胞因子，目前的研究已掌握其基本结构特征，IL-38与IL-1家族其他成员有相似的特点，在免疫组织中呈高表达[11-12]，然而它的生物学功能尚不为我们所知.研究发现IL-38能够与IL-36受体结合，因此IL-38有非典型IL-36受体阻滞剂功能，在免疫炎症过程中发挥类似IL-36受体拮抗剂的作用[13-14].最近的研究表明,在SLE、炎症性关节炎、银屑病和炎性肠病等疾病中，IL-38通过抑制炎症信号通路发挥免疫抑制作用，从而认为参与了炎症性疾病的发病[15-18].在前期研究中，发现类风湿关节炎患者外周血中IL-38表达减少，使得TH17相关转录因子高表达，造成TH17细胞数量及其细胞因子IL17表达增加，导致机体关节乃至全身性的炎症反应，引发类风湿关节炎的发生发展[19].

SLE是机体在遗传及环境双重因素的共同作用下，体内免疫系统紊乱从而产生过多的自身抗体，造成全身多系统病变，主要包括炎症信号通路及T、B淋巴细胞的活化.目前发现在狼疮鼠体内IL-38能够抑制TNF-α、IL-6和IFN-γ等的产生，并且能改善皮肤、肾脏的病变[20]. 本研究检测活动期SLE患者体内的IL-38基因及蛋白表达水平，发现其明显低于健康对照组，推测在活动期SLE患者体内由于IL-38表达减少，使其抑制免疫炎症作用下降，促进了SLE的发病，说明IL-38具有免疫抑制作用，这与目前国内外的研究结论一致.

NF-κB是调控免疫炎症相关基因转录的关键性核转录因子.已有研究证实SLE患者NF-KB活性显著高于正常对照，其活化程度与血清中IgG及抗dsDNA水平呈正相关，因此，NF-κB在SLE的发病机制中起重要作用，其中TNF-α是NF-KB通路活化的刺激因子，IKKβ是活化过程中的关键激酶.为进一步深入探究在活动期SLE患者体内IL-38是如何发挥其免疫抑制作用，本研究检测了活动期SLE患者体内TNF-α和IKKβ的表达水平，结果发现活动期SLE患者体内TNF-α和IKKβ表达水平均较正常对照组显著升高，并且通过相关性分析发现IL-38与TNF-α蛋白表达水平呈负相关，说明在活动期SLE患者体内IL-38蛋白表达水平下降，造成TNF-α的过度分泌从而通过激活IKKβ活化NF-κB通路，造成机体的免疫异常.同时在研究中发现在活动期SLE患者体内IL-38与IKKβ mRNA表达水平呈负相关，说明IL-38与 IKKβ的表达活化有关.因此，通过上述结果，推测IL-38一方面可以通过TNF-α激活IKKβ激酶，另一方面可以直接作用于IKKβ激酶，从而调控IKKβ/NF-κB通路的活化.

目前IL-38在SLE中的作用机制尚未清楚，本研究显示，在活动期SLE患者体内IL-38表达水平降低，促进体内TNF-α的大量产生从而激活IKKβ，同时IL-38表达水平下降造成IKKβ的活化，活化的IKKβ引起IκB磷酸化、泛素化和降解，使NF-κB转位入核与相应的靶基因结合，大量T、B淋巴细胞的增殖和炎症因子的产生，从而导致机体SLE的发病.通过前期以及本研究的结果，推测IL-38可能是引发自身免疫性疾病的重要原因之一，其具体机制还需要更多的基础与临床研究来探讨.