7-二氟甲氧基-5,4′-二甲氧基金雀异黄素对卵巢上皮性癌细胞增值与迁移侵袭作用机制

匡婷, 李乐赛, 陈亦乐*

(1. 南华大学 研究生院临床系， 湖南衡阳 421001； 2.湖南省肿瘤医院 妇瘤科， 湖南长沙 410013)

卵巢癌作为全球女性致死率第一的妇科肿瘤，2019年约有22 500名新发卵巢癌患者，且有超过14 000例患者死于该疾病[1]，上皮性卵巢癌是最常见的一种卵巢癌类型，同时也是近年来妇科肿瘤的研究热点.由于上皮性卵巢癌发病隐匿，70%的患者发现癌症时已处于晚期或伴有多部位转移，经临床一线治疗后缓解的患者中,有55%～75%在2年内复发[2]，且复发患者的10年无病生存率低于15%[3].因此，阐明上皮性卵巢癌转移的机制并加以干预，对于进一步提高上皮性卵巢癌的治疗效果具有重要意义.近年来，因植物类提取的天然化合物具有高功效、低毒性等优势，故将其作为预防和治疗包括癌症在内的许多疾病变得越来越受欢迎[4].

7-二氟甲氧基-5,4′-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethoxy-5,4′-dimethoxygenistein, DFMG)是以金雀异黄素(genistein，GEN)为先导化合物，设计、合成和筛选得到的一种较先导化合物活性更高的新化学实体.国内外报道DFMG具有抗炎[5]、抗动脉粥样硬化斑块的形成[6]、抗细胞凋亡[7]、抗内皮细胞迁移[8]、抑制肿瘤血管新生[9]等药理作用, 但目前国内外尚无DFMG对卵巢上皮性癌细胞(skov3)细胞增殖、迁移侵袭及抗上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)作用机制的研究, 因此本文选用卵巢癌skov3,研究DFMG对其生物学行为的影响及初步机制探索,以期为DFMG用于卵巢癌治疗提供相关理论基础及实验依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源

卵巢癌细胞系skov3购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心.

1.1.2 主要试剂

RPMI 1640、胎牛血清和胰蛋白酶(美国Gibco公司); DFMG由湖南师范大学医学院病理生理系提供; CCK-8试剂(唯赞公司);Transwell小室(美国Corning公司);基质胶(美国BD公司);SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、RIPA蛋白裂解液与苯甲基磺酰氟 (PMSF)(上海碧云天);BCA蛋白浓度测定试剂盒及蛋白上样缓冲液、青霉素和链霉素溶液(北京索莱宝科技公司);兔抗人钙粘附蛋白E(E-cadherin)多克隆抗体、兔抗人波形蛋白(vimentin)多克隆抗体、鼠抗人GAPDH多克隆抗体(武汉三鹰公司); E-cadherin、vimentin、GAPDH引物 (上海生工公司)；荧光二抗(北京中杉金桥生物公司).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

skov3以RPMI 1640培养基加体积分数10%胎牛血清及青霉素和链霉素,在体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中培养, 每日更换新鲜细胞培养液,细胞生长铺满80%瓶壁时, 胰酶消化传代.

1.2.2 药物制备

DFMG(自主合成,纯度>99%,分子式为C18H14O5F2,相对分子质量348,性状为淡黄色晶体粉末)溶解于二甲基亚砜 (DMSO),并控制DMSO质量浓度为0.1%, 在4 ℃存放.

1.2.3 CCK-8法检测DFMG对skov3细胞增殖的影响

将skov3按5 000/孔细胞接种于96孔板，培养24 h后, 加入不同浓度 (0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)DFMG培养24 h后, 再加入CCK-8试剂, 37 ℃孵育1h后测得吸光度值并计算其增值抑制率；最后计算出DFMG对skov3的IC50，作为后续研究的药物浓度.

1.2.4 划痕实验测定skov3迁移能力

skov3按1×107/mL的密度接种于6孔板，每孔1 mL细胞悬液, 至细胞融合率达80%左右时，使用200 μL枪头尖端在单层细胞的中间刮出一条划痕.PBS洗涤3次后,将skov3分为空白组、溶剂组(质量浓度0.1% DMSO)、DFMG组，并根据不同条件培养基培养3组细胞24 h后,显微镜(40×)下随机选择3个视野,计算划痕面积迁移率,其公式为：迁移率=(ST0-ST24)/ST0×100%.

1.2.5 Transwell实验检测skov3的侵袭能力

使用24孔板及8 μm孔径Transwell小室进行skov3细胞侵袭实验.于冰上用无血清培养基稀释基质胶 (V基质胶∶V稀释液=1∶8),取50 μL均匀覆盖在上室, 37℃孵育1h使胶凝固.先消化细胞，再用无血清RPMI1640培养基终止消化且制备成密度为1×108/L的细胞悬液,取100 μL 悬液接种于Transwell上室,按不同条件培养3组skov3，即空白组、溶剂组、DFMG组.下室加入500 μL含有体积分数20%胎牛血清的生长培养基.在37 ℃下孵育48 h.PBS清洗上下室3次,固定并染色后在显微镜下观察、计数.

1.2.6 Western blotting检测skov3不同处理组EMT的表达水平

将skov3按5×106/mL的密度种于6孔板,每孔1 mL,根据不同处理条件将skov3细胞分为:空白组、溶剂组、DFMG组，分别处理24 h后,收集各组细胞总蛋白,加入蛋白上样缓冲液(5×)变性, 配制SDS-PAGE凝胶, 每孔蛋白上样量约为15 μg, 开始电泳, 待溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳, 转膜并封闭.随后进行一抗 (E-cadherin/vimentin稀释比例V抗体∶V稀释液=1∶1 000;GAPDH稀释比例V抗体∶V稀释液=1∶10 000)和二抗(V抗体∶V稀释液=1∶10 000)的孵育.最后用ECL类试剂和显影仪来检测蛋白.用Image J软件测定光密度值分析E-cadherin和vimentin的蛋白相对表达量.

1.2.7 免疫荧光检测skov3不同处理组EMT的表达水平

将处于对数增长期的skov3,制备密度成1×105/L的细胞悬液，接种于放有无菌玻片的12孔板中接种至含有玻璃片的24孔板内，且按空白组、溶剂组、DFMG组分组培养24 h后.采用细胞免疫荧光染色法检测skov3中EMT标志物E-cadherin、vimentin的表达,简要步骤如下:细胞爬片后经多聚甲醛溶液固定,即用Triton X-100室温通透10 min,PBS冲洗5×3 min, BSA室温下封闭30 min,兔抗人一抗E-cadherin (V抗体∶V稀释液=1∶100)及vimentin (V抗体∶V稀释液=1∶100) 4 ℃孵育过夜, PBS冲洗5×3 min, FITC标记羊抗兔二抗避光常温孵育1 h，PBS冲洗5×3 min，DAPI复染核，再用PBS冲洗5×3 min.用甘油封片,激光共聚焦显微镜观察并拍照,对荧光染色结果进行定量分析.

1.2.8 qRT-PCR法检测skov3不同处理组EMT相关基因表达

将skov3按1×106/mL的密度种于6孔板,每孔1 mL,根据不同处理条件将skov3分为:空白组、溶剂组、DFMG组，培养24 h后，用Trizol试剂提取各组细胞总RNA,紫外分光光度计检测浓度及纯度.应用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)在美国Bio-Rad C1000 PCR仪上进行,每样本设3个复孔,反应条件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,58 ℃ 5 s,扩增40个循环.基因表达情况采用2-ΔΔCt法进行相对表达量分析.

1.3 统计学处理

所有实验均重复3次，计量资料以(均数±标准差)表示.两组间比较采用t检验,多组间均数比较采用方差分析,2检验,P<0.05为差异有统计学意义，用Graphpad prism 5.0软件作图.

2 结果

2.1 DFMG对skov3增值活性的影响

分别用浓度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L的DFMG处理细胞24 h后，观察细胞增值活力(图1)，从DFMG浓度为40 μmol/L开始，细胞的增值活力明显受抑制(P<0.05)，半数药物抑制浓度(IC50)为(113.1±12.1)μmol/L,于是选取113 μmol/L DFMG浓度作为后续所有实验的研究浓度(与空白对照组相比，溶剂组对细胞生长无抑制作用).

2.2 DFMG对skov3迁移与侵袭能力的影响

DFMG能降低skov3的迁移和侵袭的能力.在细胞伤口愈合实验中，DFMG组细胞的迁移率均为32% 明显低于于空白组64.33%(图2A).在Transwell侵袭实验中，DFMG组的侵袭细胞数量(78个细胞)显著减少(图2B)；结果与空白组(225个细胞)相比，差异统计学意义(P<0.05).

与空白组比较，1)P<0.05，2)P<0.01Compared with the blank group，1)P<0.05，2)P<0.01

与空白组比较，1)P<0.05Compared with the blank group，1)P<0.05A：划痕实验：检测细胞迁移能力；B：Transwell实验：检测细胞侵袭能力.A：Wound healing test: detecting the migration ability of cells B：Transwell test: detecting the invasion ability of cells.

2.3 DFMG对skov3 EMT的影响

Western blot、细胞免疫荧光及qRT-PCR检测结果显示,DFMG处理后的skov3与空白组相比，E-cadherin蛋白及mRNA表达均增高而vimentin蛋白及mRNA表达均显著降低(P<0.05,图3A、3B).

与空白组比较，1)P<0.05Compared with the blank group，1)P<0.05A、D：蛋白免疫印迹实验和细胞免疫荧光实验检测EMT相关指标蛋白变化；B、C：qRT-PCR检测EMT相关指标mRNA变化.A、D：Western blot and cellular immunofluorescence tests：detecting protein changes of EMT; B、C：qRT-PCR: detecting mRNA changes of EMT.

3 讨论

GEN，一种植物类天然异黄酮化合物，具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤等功效. DFMG是其化学合成衍生物，且化学活性高于GEN.近年来有研究显示：DFMG能通过抑制TLR4表达减少内皮细胞的迁移能力[8]；DFMG能通过线粒体凋亡途径促进宫颈癌细胞(hela)凋亡[10]；DFMG还可通过TLR4/NF-κB途径显著抑制白血病细胞血管新生[9]等.尽管DFMG目前抗肿瘤的分子机制研究不多，但把DFMG作为研发新的抗肿瘤药仍具有广泛的前景.

上皮性卵巢癌的死亡率已占据女性生殖器官恶性肿瘤首位，具有发病隐匿、高转移性和易耐药的特点，临床治疗常为：手术联合化疗的标准治疗方案并辅以靶向及免疫治疗，但其治疗效果仍差，5年生存率低于30%[11].因此，发现新的靶分子或药物可为提高卵巢癌治疗及预后提供更好的研究方向.EMT在肿瘤侵袭和转移中具有重要作用，是肿瘤发生转移的第一步[12].近年来越来越多的研究将逆转EMT作为抗卵巢癌转移的重要研究方向[13-15].

EMT是指在某些生理和病理状态下出现的上皮细胞向间质细胞转化的现象，细胞间的粘附力降低，而癌细胞的迁移、侵袭能力增加[16]；在这个过程中，上皮细胞发生去上皮化、丧失极性，上皮细胞的标志分子(E-cadherin、ZO-1等)表达逐步下降，而细胞骨架重构、细胞形态改变，表达间质性细胞的标志分子(如：vimetin、N-cadherin等)增加[17-19].随着正常细胞、组织形态及构架被打破，为癌细胞的转移与复发提供了合适的环境，因此，开发有效抑制上皮性卵巢癌EMT过程的药物具有重要意义.

目前，植物提取物的抗肿瘤EMT作用逐步受到关注[20].植物提取物具有原料容易获得、价格较为便宜、非人工合成的独特优势，一直是治疗药物的来源和药物加工的基础.本实验通过CCK-8法检测发现浓度为40 μmol/L的DFMG开始显著抑制卵巢癌skov3的增殖能力,并存在浓度依赖性，IC50为(113.1±12.1)μmol/L.细胞划痕实验发现卵巢癌skov3细胞的迁移率受DFMG抑制,且均具有统计学意义.进一步行Transwell侵袭实验发现,经113 μmol/L DFMG处理后的细胞穿过小室的细胞明显少于对照组,DFMG显著抑制卵巢癌skov3的迁移、侵袭能力.为探讨DFMG抑制卵巢癌skov3的体外增殖和迁移、侵袭能力的机制,本研究进一步进行Western Blot、细胞免疫荧光和qRT-PCR实验法检测E-cadherin、vimentin蛋白和mRNA的表达,结果显示,DFMG处理后的skov3 E-cadhein的蛋白和mRNA增高，而vimentin的蛋白和mRNA减少.这一结果提示DFMG抑制卵巢癌skov3的体外增殖和迁移、侵袭能力,可能与其逆转癌细胞EMT有关.

综上所述,本实验证实了DFMG能抑制skov3增殖、迁移和侵袭能力，可能与其逆转癌细胞EMT有关.这可为下一步寻找卵巢癌的新疗法提供一定的理论基础及实验依据，但其更为详细的调节机制有待进一步探讨.