成都地区骨科患者伤口金黄色葡萄球菌感染的分子流行病学及耐药性分析

孙梦瑗， 汪璐， 曲远青， 王艳艳， 万娜

(西部战区总医院 检验科， 四川 成都 610083)

由于创伤及外科操作等因素致骨科患者伤口感染最为常见，而许多伤口感染防控不当会进一步导致创面难以愈合、深部组织感染甚至全身感染等不良后果[1].在所有骨科伤口感染相关病原菌之中，金黄色葡萄球菌分离率最高、最受关注[2].耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)是甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus, MSSA)获得携带有耐药基因的外源性葡萄球菌染色体盒(staphylococcal cassette chromosomemec,SCCmec)后形成的，MRSA的广泛、持续流行给金黄色葡萄球菌感染的防治带来了巨大的挑战[3].

对细菌进行分子流行病学和耐药性分析，是有效防治感染的重要基础研究[3-4].分子分型是分子流行病学的主要研究方法，多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和金黄色葡萄球菌A蛋白基因(spa)分型是金黄色葡萄球菌最常用的分子分型方法，MRSA菌株还可以根据其SCCmec不同进行分型，获得这些分型结果对于认识细菌的分子流行特征、了解和预判细菌的流行趋势有重要作用[3-4].毒力因子是细菌致病的重要因素，对毒力因子携带的检测也是分子流行病学的重要内容，它有助于寻找与细菌致病相关的毒力因子[5].而耐药性分析不仅是耐药监测的重要内容，也有助于临床医生选择更有效的抗生素进行经验性抗感染治疗[4,6].此外，由于MRSA与MSSA在分子流行病学和耐药性方面常表现出诸多不同，因此在进行相关研究时，将二者分别分析并加以比较是非常有必要的[3,6].

为了解成都地区骨科伤口相关金黄色葡萄球菌的分子流行病学与耐药性特征，以制定更有效的细菌防治策略，本研究小组收集了我院骨科分离自伤口分泌物的金黄色葡萄球菌，对其进行了分子分型、毒力因子检测和耐药性的研究，并将MRSA与MSSA菌株进行了分析比较，现报告如下.

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本研究收集了2016年9月至2019年9月间，分离自西部战区总医院骨科住院患者伤口分泌物的金黄色葡萄球菌.在纳入研究菌株时，分离自同一患者不同部位的菌株只纳入一株，同一患者不同时间点分离的菌株只纳入首次分离的菌株.最终本研究共纳入195株细菌为研究对象.将金黄色葡萄球菌ATCC29213作为质控菌株(购买自卫生部临床检验中心).

1.2 细菌的分离鉴定

以生理盐水冲洗清洁创面后，用无菌棉拭子采集分泌物，之后送往实验室接种培养.操作流程严格按照《全国临床检验操作规程》第四版执行[7].应用生物梅里埃API staphy system进行金黄色葡萄球菌的鉴定，并通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增金黄色葡萄球菌特异性基因femB进一步确认结果[2].

1.3 分子分型方法

1.3.1 MRSA菌株鉴定及其SCCmec分型

通过PCR扩增mecA基因(编码青霉素结合蛋白PBP2a)鉴定MRSA菌株，mecA基因阳性菌株为MRSA，阴性为MSSA[2].参照文献[3-4]，PCR扩增mec复合物和ccr复合物各基因组分，通过扩增片段的带型与长度判断SCCmec型别.

1.3.2 MLST分型

PCR扩增金黄色葡萄球菌7个管家基因(arcC,aroE,glpF,gmk,pta,tpi和yqiL)的序列片段；扩增片段测序后，将每株细菌的各管家基因序列分别与数据库(http://saureus.mlst.net/)中的序列进行比对，得到对应的序列编号；各株细菌7个序列编号组合后即可得到对应的序列分型(sequence type, ST)[4].

1.3.3spa分型

PCR扩增并测序spa基因片段，根据其可变区(X区)重复序列出现次数及排列方式，比对数据库(http://spaserver.ridom.de/)信息确定菌株spa型别[4].

1.4 毒力基因检测

采用PCR方法检测毒力因子的携带情况.共检测金黄色葡萄球菌较常见的20种毒力因子，包括10种黏附相关毒力基因(icaA,icaD,fnbA,fnbB,clfA,clfB,fib,cna,eno,ebpS)与10种外毒素基因(hla,hlb,hld,hlg,pvl,tst,sea,seb,sec,sed)[2].

1.5 药敏测试

应用贝克曼公司MicroScan system进行抗菌药物敏感性测试，12种常见的金黄色葡萄球菌抗菌药物参与检测，包括青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)、复方新诺明(SXT)、红霉素(ERY)、环丙沙星(CIP)、克林霉素(CLI)、利福平(RIF)、莫西沙星(MFX)、庆大霉素(GEN)、四环素(TCY)、万古霉素(VAN)和利奈唑胺(LNZ).药敏结果的判定按照2019年版美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute, CLSI)相关标准[8].

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 分子分型结果

2.1.1 MRSA菌株鉴定及其SCCmec分型

195株纳入研究的菌株经PCR扩增femB基因，均进一步确认为金黄色葡萄球菌.经PCR扩增mecA基因，发现41株为MRSA(mecA阳性)，154株为MSSA(mecA阴性)，MRSA检出率为21.0%.MRSA菌株的SCCmec分型结果显示，共鉴定出5种SCCmec型别，以SCCmecⅠ(41.5%，17/41)和SCCmecⅣ(36.6%，15/41)型为主，另有少量SCCmecⅢ、Ⅱ、Ⅳ型(表1).

表1 分子分型结果Table 1 Results of molecular typing n(%)

2.1.2 MLST分型

所有MRSA和MSSA菌株分别被分为9个和26个ST型别.两类菌株均显示出较明显的优势型别，其中MRSA菌株以ST59(58.5%，24/41，P<0.01)、ST630(17.1%，7/41，P=0.07)为优势型别，而MSSA菌株以ST188(22.1%，34/154，P<0.01)、ST6(13.6%，21/154，P<0.05)为优势型别(表1).此外，表1中“其他”MLST型别在MSSA菌株中所占比例显著高于MRSA菌株(P<0.01)，提示MSSA菌株MLST分型更具多样性.

2.1.3spa分型

所有MRSA和MSSA菌株分别被分为11个和34个spa型别，二者亦各有其优势型别.其中，MRSA菌株以t437(43.9%，18/41，P<0.01)为优势型别，而MSSA菌株的优势型别为t189(19.5%，30/154，P<0.01)和t701(10.4%，16/154，P=0.07),见表1.

2.2 毒力基因检测

各毒力基因携带情况详见表2.所有菌株中均检测到携带有icaA、icaD、clfA、clfB、eno和hld基因，其他携带率较高的毒力基因还包括fib、hla和hlg(携带率均>90%)；而tst、sea携带率则较低(携带率均<10%).值得注意的是，对于MRSA菌株而言，cna基因(编码胶原蛋白粘附素，P<0.01)和ebpS基因(编码弹性结合蛋白,P<0.05)检出率显著低于MSSA菌株，而hlb基因(编码β溶血素)和seb基因(编码肠毒素B)检出率显著高于MSSA菌株(均为P<0.01).

2.3 耐药性分析

所有受检金黄色葡萄球菌对青霉素、红霉素、克林霉素和四环素的耐药率较高，而对复方新诺明、环丙沙星、利福平、莫西沙星和庆大霉素耐药率则相对较低，未发现万古霉素和利奈唑胺耐药菌株(表3).MRSA菌株对苯唑西林(P<0.01)、红霉素(P<0.05)和克林霉素(P<0.05)的耐药性均显著高于MSSA菌株.此外，并非所有经mecA基因检测确认为MRSA的菌株都对苯唑西林敏感(85.4%，35/41)，而mecA阴性的菌株也有少量对苯唑西林耐药(8.4%，13/154).

表2 毒力基因检测结果Table 2 Results of virulence genes detection n(%)

表3 耐药率结果分析Table 3 Results of drug resistance rates n(%)

3 讨论

由于骨科开放性伤口较为常见、开放性外科操作较多，使得伤口感染成为骨科住院患者中最常见的感染类型，它也是影响患者预后的重要因素[1].金黄色葡萄球菌作为伤口感染最常见的病原菌，对其进行分子流行病学和耐药性研究，对于解决骨科伤口感染问题有重要意义[1-2].但目前专门针对骨科金黄色葡萄球菌伤口感染的分子流行病学研究较少，本研究结果为骨科金黄色葡萄球菌感染的流行病学研究和抗菌策略的制定都提供了重要参考.

金黄色葡萄球菌在骨感染中之所以备受关注，除因其分离率较高外，MRSA的广泛流行与传播也是重要原因[3,6].MSSA获得mecA基因后成为MRSA菌株，MRSA常表现为对多种抗生素耐药，给临床感染的治疗带来了困难.同时，由于MRSA携带与耐药相关的可移动性基因元件，这为其耐药性的遗传提供了便利，因此MRSA的防控是临床上一直重点关注的领域[6,9].2018年全国耐药监测网数据显示，全国MRSA检出率为30.9%，四川地区为28%，本研究中MRSA的检出率为21.0%，低于上述数据.同时对比近年来的其他类似研究，我院骨科MRSA检出率较山东地区程方圆等[10]的研究、天津地区张静会等[11]的研究和浙江地区江琰笛等[12]的研究低，而与重庆地区王轶男等[13]的研究数据相近，这可能与四川和重庆地理上的相近有关.

目前国内报道的MRSA菌株SCCmec分型主要以SCCmecⅢ型为主，主要是因为相关研究主要聚焦于医院获得性MRSA，而SCCmecⅢ型是亚洲地区造成医院感染MRSA的最主要原因，同时其传播性也较强[14].而在本研究中的MRSA菌株主要以SCCmecⅠ、Ⅳ型为主(分别占比41.5%、36.6%)，SCCmecⅢ型只占14.6%，这可能与我院骨科患者中MRSA的医院获得性感染较少有关，同时也提示应警觉SCCmecⅠ、Ⅳ型可能引起的院内传播问题.在MLST和spa分型方面，与以往研究结果类似的是，本研究结果也提示MRSA的型别相对单一，而MSSA的型别则较为多样化[15]，这可能与MRSA具有的传播性相关.本研究中ST59、ST630和t437是MRSA的优势型别，且发现其中的t437菌株多数属于ST59菌株，ST59-t437是MRSA菌株的优势型别组合(41.5%，17/41).上述结果与既往报道有所不同，既往研究显示中国大陆地区最优势的MRSA型别组合多为ST239-t037/t030[16]，但在重庆地区王轶男等[13]的研究中，ST59-t437菌株也占据了MRSA菌株的较大比例，这不仅提示了骨科菌株的特异性，也进一步提示了成都与重庆在地理上的相近对细菌流行病学特征的影响.对MSSA而言，其优势型别为ST188、ST6和t189，且其中的t189也多数属于ST188菌株，ST188-t189是MSSA菌株中的优势型别组合(16.2%，25/154).由于MSSA菌株分型常较多样，很多研究提示其没有绝对优势的分子型别[17]，Li等[18]从中国4个城市8家医院所获得的数据曾提示ST188-t189在MSSA菌株中较为常见，与本研究结果类似，可见该型别很可能是大陆地区流行率较高且流行较为广泛的MSSA型别，在今后的研究中值得加以关注.

进行毒力基因的检测不仅有助于了解细菌致病机制，还有助于更深入地分析细菌的遗传背景[5].既往的研究对于MRSA和MSSA菌株毒力因子的携带率是否存在差异尚有争论.本研究显示MSSA菌株携带cna和ebpS基因的比例显著高于MRSA菌株，而hlb和seb基因的比例显著低于MRSA.对比既往报道，王俊瑞等[19]也发现MSSA菌株的ebpS携带率较高，但在这一研究中cna携带率反而在MRSA中较高；在刘彩林[20]的研究中，hlb被发现在MSSA中的携带率较高.而邵富叶[21]的研究则显示MRSA和MSSA菌株毒力基因携带率没有差别.本研究结果还发现在MSSA优势分型菌株中，所有25株ST188-t189-MSSA均携带有cna基因，20/21的ST6-MSSA携带有ebpS基因；而在MRSA优势分型菌株中，所有ST59和ST630 MRSA(共31株)均携带hlb基因，其seb的携带率也高达41.9%(13/31).在本研究中可能由于MRSA和MSSA的优势菌株携带上述基因的频率较高，造成了这些基因在两类细菌中存在携带率的差异，这一现象在既往文献中尚未见报道.而上述关联性也提示某些分子分型的金黄色葡萄球菌可能更容易携带某些毒力因子，从而发挥致病作用，但其机制尚有待探究.

细菌的耐药性分析有助于了解耐药现状，指导临床用药.本研究结果提示，在进行经验性抗金黄色葡萄球菌感染治疗时，环丙沙星、莫西沙星、利福平、庆大霉素、万古霉素和利奈唑胺可能效果较好，而青霉素、红霉素、克林霉素、四环素等则效果较差.在MRSA和MSSA耐药性对比方面，本研究提示MRSA对苯唑西林、红霉素和克林霉素耐药性比例显著高于MSSA菌株，因此这几种药物不推荐用于MRSA相关感染的治疗，冯强生等[22]和樊芙蓉等[23]的研究也呈现了类似的结果.此外，本课题组注意到由于采用PCR扩增mecA基因这一“金标准”界定MRSA菌株，而非临床上常采用的头孢西丁/苯唑西林纸片法，使得MRSA菌株中有14.6%未表现出苯唑西林耐药，这提示两种方法的检测结果可能存在较大的差异性，因此在进行相关研究时使用扩增mecA基因界定MRSA应作为较为稳妥的方法加以推荐.

四川成都地区骨科伤口感染金黄色葡萄球菌主要分子型别为ST59/ST630-t437-MRSA-SCCmecI/IV和ST188-t189-MSSA.与MSSA菌株相比较，MRSA菌株hlb和seb携带率较高，而cna和ebpS基因携带率较低，在本研究中,ST59和ST630 MRSA 的hlb、seb携带率较高，ST188-t189和ST6 MSSA的can、ebpS携带率较高,这种结果与分子分型结果相对应.耐药分析结果提示临床某些抗生素可在经验性抗金黄色葡萄球菌治疗中优先选择，本研究为了解骨科伤口感染金黄色葡萄球菌流行病学现状、制定抗菌策略提供了参考.