长链非编码RNA LINC00478抑制微小RNA-214 对口腔鳞癌细胞顺铂耐药性的影响

李冠睿, 李建武, 颜家渝,3*

(1.成都中医药大学附属医院, 四川 成都 610072； 2.临沂市中医医院, 山东 临沂 276003； 3.成都中医药大学 附属广安医院/广安市中医医院, 四川 广安 638600)

口腔鳞癌是临床常见的恶性肿瘤之一，近年来，口腔鳞癌发病率与死亡率逐年升高，随着抗肿瘤药物的研发，口腔鳞癌患者复发率及生存率仍较低.口腔鳞癌细胞对化疗药物的耐药性是降低治疗效果及造成患者预后不良的重要原因之一[1],因而探究口腔鳞癌耐药性产生的分子机制及寻找逆转耐药的方法成为研究重点.非编码RNA主要包括微小RNA(micro RNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)，研究报道指出非编码RNA在口腔鳞癌中异常表达，可对肿瘤细胞化疗耐药性产生重要作用，还可调控细胞增殖及凋亡等过程[2-4].LncRNA LINC00478在乳腺癌中表达水平降低，可能参与乳腺癌发生及发展过程[5].但LINC00478在口腔鳞癌细胞顺铂耐药性中的作用尚未可知.生物信息学分析显示miR-214可能是LINC00478的靶基因，miR-214在口腔鳞癌中表达水平升高，可促进细胞迁移及侵袭[6].但LINC00478是否可通过靶向调控miR-214从而影响口腔鳞癌细胞顺铂耐药尚未可知.因此，本研究主要探讨LINC00478对口腔鳞癌顺铂耐药性细胞增殖及凋亡的影响，探究其对miR-214的靶向调控作用，为口腔鳞癌化疗药物耐药的防治提供新方向.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

口腔鳞癌组织与癌旁组织标本来源：选取2017年3月至2018年10月本院收治的28例口腔鳞癌患者为研究对象，其中男18例，女10例，年龄50～70岁，平均年龄(63.25±8.52)岁，所有患者均经病理证实为口腔鳞癌，术中切除口腔鳞癌组织、癌旁组织，置于液氮中保存.

口腔鳞癌细胞CAL-27购自美国ATCC公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清、胰蛋白酶、Lipofectamine2000购自美国Thermo Fisher公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录与荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；MTT试剂、DMSO、细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma公司；pcDNA 3.1购自上海泽叶生物有限公司；miR-214寡核苷酸模拟物(miR-214 mimics)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)购自上海吉玛制药技术有限公司；兔抗人Ki67、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3抗体购自美国CST公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司.

1.2 方法

1.2.1 实验分组

耐药细胞株CAL-27/DDP的诱导：取对数生长期CAL-27细胞，待细胞生长融合度达到70%时加入质量浓度为0.1 mg/L 顺铂的培养液培养24 h，弃旧培养基，加入新鲜培养基继续培养，待细胞生长至正常状态，加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化进行传代培养，加入含有质量浓度为0.2 mg/L 顺铂的培养液培养24 h，后续过程中逐步提高顺铂质量浓度直至细胞不耐受，最终获得能耐受质量浓度1 mg/L顺铂的稳定耐药细胞株，记作CAL-27/DDP细胞[7].取对数生长期CAL-27/DDP细胞，分别将pcDNA、pcDNA-LINC00478、pcDNA-LINC00478与miR-NC、pcDNA-LINC00478与miR-214 mimics转染至CAL-27/DDP细胞，分别记作pcDNA组、pcDNA-LINC00478组、pcDNA-LINC00478+miR-NC组、pcDNA-LINC00478+miR-214组.

1.2.2 qRT-PCR检测细胞中LINC00478、miR-214的表达水平

取冻存口腔鳞癌组织、癌旁组织、CAL-27细胞、CAL-27/DDP细胞与转染后各组CAL-27/DDP细胞，采用Trizol法提取总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA质量.反转录体系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，FastKing RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μL；反应条件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min.反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O补足体系至25 μL；反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36次循环.LINC00478以GAPDH为内参，miR-214以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算LINC00478、miR-214相对表达量.

1.2.3 MTT检测细胞增殖

取各组CAL-27/DDP细胞接种于96孔板(1×104/孔)，每孔加入20 μL质量浓度为5 mg/mL的MTT溶液，置于培养箱内继续培养4 h，弃上清，分别加入150 μL DMSO，室温避光孵育5 min，应用酶标仪检测各孔吸光度值(D值)，计算细胞增殖抑制率(%)=(D对照组-D实验组)/(D对照组-D空白组)×100%.

1.2.4 平板克隆形成实验

取各组CAL-27/DDP细胞接种于6孔板(5×104/孔)，置于培养箱内继续培养，每24 h更换一次培养液，继续培养14 d，加入预冷PBS洗涤，分别加入500 μL甲醇，置于-20 ℃冰箱内孵育20 min，弃甲醇，每孔加入400 μL质量分数1%结晶紫染色液，室温孵育15 min，回收结晶紫染色液，采用流动水洗涤3 min，晾干，拍照.

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡率

取各组CAL-27/DDP细胞，加入质量分数0.25%胰蛋白酶消化，加入PBS清洗，弃上清，分别加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，参照细胞凋亡检测试剂盒分别加入5 μL Annexin V-FITC，充分混匀，加入5 μL PI，充分混匀，室温避光孵育10 min，应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.

1.2.6 双荧光素酶报告实验检测LINC00478与miR-214靶向关系

LncBase v.2预测显示LINC00478与miR-214的结合位点，构建野生型载体WT-LINC00478与突变型载体MUT-LINC00478，分别将WT-LINC00478、MUT-LINC00478与miR-NC、miR-214 mimics共转染至CAL-27/DDP细胞，置于培养箱内继续培养48 h，收集细胞并检测荧光素酶活性.

1.2.7 蛋白免疫印迹(Western blot)检测Ki67、Pro-caspase3、Cleaved-caspase3蛋白表达

取各组CAL-27/DDP细胞，提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度.蛋白样品中加入5×SDS上样缓冲液，沸水煮10 min，蛋白变性，取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳反应，转移至PVDF膜，室温封闭2 h，分别加入一抗稀释液(V一抗∶V抗体稀释液=1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤，分别加入二抗稀释液(V二抗∶V抗体稀释液=1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗涤，暗室内曝光显影，应用ImageJ软件分析各条带灰度值.

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 LINC00478、miR-214在口腔鳞癌中的表达

与癌旁组织比较，口腔鳞癌组织LINC00478的表达水平显著降低(P<0.05)，miR-214的表达水平显著升高(P<0.05)(表1).与CAL-27组比较，CAL-27/DDP组LINC00478的表达水平显著降低(P<0.05)，miR-214的表达水平显著升高(P<0.05)(表2).

2.2 各个分组处理的CAL-27/DDP细胞抑制率

与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00478组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.05)；与pcDNA-LINC00478+miR-NC组比较，pcDNA-LINC00478+miR-214组细胞增殖抑制率显著降低(P<0.05)(表3).

表1 LINC00478、miR-214在口腔鳞癌组织中的表达

表2 LINC00478、miR-214在CAL-27和CAL-27/DDP中的表达

表3 各个分组处理CAL-27/DDP细胞抑制率的检测

2.3 各个分组处理的CAL-27/DDP克隆形成数

与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00478组克隆形成数显著减少(P<0.05)；与pcDNA-LINC00478+miR-NC组比较，pcDNA-LINC00478+miR-214组克隆形成数显著增多(P<0.05)(图1、表4).

2.4 各个分组处理的CAL-27/DDP凋亡率

与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00478组凋亡率显著升高(P<0.05)；与pcDNA-LINC00478+miR-NC组比较，pcDNA-LINC00478+miR-214组凋亡率显著降低(P<0.05)(图2、表5).

图1 克隆形成数的检测

表4 各个分组处理CAL-27/DDP克隆形成数的检测

表5 各个分组处理的CAL-27/DDP凋亡率的检测

图2 凋亡率的检测

2.5 双荧光素酶报告实验验证LINC00478与miR-214靶向关系

LncBase v.2预测显示LINC00478与miR-214存在结合位点(图3).双荧光素酶报告实验结果显示，miR-214能够抑制WT-LINC00478荧光素酶活性(P<0.05)，而对MUT-LINC00478荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)(表6).与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00478组miR-214的表达水平显著降低(P<0.05)(表7).

2.6 Western blot检测各个分组处理CAL-27/DDP中蛋白的表达

与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00478组Ki67、Pro-caspase3蛋白水平显著降低(P<0.05)，Cleaved-caspase3蛋白水平显著升高(P<0.05)；与pcDNA-LINC00478+miR-NC组比较，pcDNA-LINC00478+miR-214组Ki67、Pro-caspase3蛋白水平显著升高(P<0.05)，Cleaved-caspase3蛋白水平显著降低(P<0.05)(图4、表8).

图3 LINC00478靶向miR-214

表6 双荧光素酶报告实验Table 6 Double luciferase report experiment

表7 miR-214的表达水平Table 7 Expression of miR-214

图4 Ki67、caspase3蛋白的表达

表8 各个分组处理CAL-27/DDP中蛋白的表达Table 8 The expression of protein in CAL-27/DDP processed by each group

3 讨论

口腔鳞癌细胞顺铂耐药过程与miRNA及多种基因异常表达密切相关，既往研究显示miRNA在口腔鳞癌细胞顺铂耐药性中发挥重要调控作用[8-10].但LncRNA在口腔鳞癌细胞顺铂耐药性过程中的作用机制尚未阐明.

LINC00478在乳腺癌组织中表达水平降低，并可能通过竞争性结合miRNA从而参与乳腺癌发生过程[11].本研究结果显示口腔鳞癌组织LINC00478的表达水平显著降低，进一步分析显示顺铂耐药细胞CAL-27/DDP中LINC00478的表达水平显著降低，提示LINC00478在口腔鳞癌发生过程中可能发挥抑癌基因作用，还可能作为逆转口腔鳞癌细胞顺铂耐药性的关键基因.本研究结果显示LINC00478过表达可明显提高细胞增殖抑制率及减少克隆形成数，提示LINC00478过表达可抑制CAL-27/DDP细胞增殖.研究表明Ki67在细胞周期中发挥重要作用，可促进细胞周期进展从而促进细胞增殖[12].本研究结果显示LINC00478过表达可抑制Ki67表达，进一步证实LINC00478过表达可减弱CAL-27/DDP细胞增殖能力.caspase3是细胞凋亡的执行因子，当caspase级联反应被激活后Pro-caspase3生成量减少，而Cleaved-caspase3生成量增多从而促进细胞凋亡[13].本研究结果显示LINC00478过表达后CAL-27/DDP细胞凋亡率明显升高，Pro-caspase3表达水平降低，Cleaved-caspase3表达水平升高，提示LINC00478过表达可促进CAL-27/DDP细胞凋亡.

LncRNA HOXA11-AS通过抑制miR-214-3p表达而促进口腔鳞状细胞癌细胞增殖及顺铂耐药性[14].HOTAIR/miR-214/ST6GAL1通路可抑制结直肠癌发展进程[15].LncRNA LINC01535通过靶向miR-214/EZH2分子轴而促进宫颈癌的进展[16].miR-214-3p通过靶向ST6GAL1而调节三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭及迁移[17].本研究结果显示口腔鳞癌组织中miR-214的表达水平升高，CAL-27/DDP细胞中miR-214的表达水平升高，提示miR-214表达上调可能促进口腔鳞癌发生，还可能降低细胞顺铂敏感性.本研究采用双荧光素酶报告实验证实LINC00478能够靶向结合miR-214，并可通过竞争性结合miR-214从而负向调控其表达.本研究将pcDNA-LINC00478与miR-214 mimics共转染至CAL-27/DDP细胞，结果显示增殖抑制率、凋亡率明显降低，克隆形成数明显增多，并可抑制Cleaved-caspase3表达及促进Ki67、Pro-caspase3表达，提示miR-214过表达可降低LINC00478过表达对CAL-27/DDP细胞增殖及凋亡的作用.

综上所述，LINC00478过表达可通过靶向抑制miR-214表达而抑制口腔鳞癌细胞增殖及促进细胞凋亡从而降低细胞顺铂耐药性，LINC00478可能作为增强口腔鳞癌细胞顺铂敏感性的关键基因，并可能作为口腔鳞癌靶向治疗的潜在靶点.但关于其具体作用机制仍需深入探究.