2018年江苏泰州地区食源性人兽共患病原菌流行现状监测

颜 卫 , 傅宏庆 , 李啸雪 , 卢贤忠 , 徐学良 , 巢钰阳

(江苏农牧科技职业学院 宠物科技学院，江苏 泰州 225300)

食源性疾病是食品安全的主要问题，世界卫生组织(WHO)将食源性疾病定义为“通过摄食进入人体导致人体患感染性或中毒性的疾病”。WHO估算每年有多达 6 亿人因食用受到污染的食品而生病，所有食源性疾病中58.2%由细菌引起[1]。食源性病原菌中有许多是人兽共患病原菌。WHO及世界动物卫生组织(OIE)指出，引起人致病的重要食源性人兽共患细菌主要包括沙门菌、大肠杆菌 O157∶H7、单核细胞增生性李斯特菌、空肠弯曲菌等。本试验从食品、人群、动物3个维度对沙门菌、弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌3种食源性人兽共患细菌的流行现状进行监测，及时的风险预警具有重要的公共卫生学意义。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂 缓冲蛋白胨水(BPW)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)、三糖铁琼脂(TSI)、脑心浸液肉汤(BHI)、科玛嘉显色培养基、水解酪蛋白培养基(MH)、WS琼脂、布氏肉汤、Carry-Blair运送培养基，均购自北京陆桥生物技术有限责任公司；CCDA、李斯特选择培养基OXFORD，购自OXOID公司；李斯特增菌培养基，购自BD公司；微氧产气袋，购自MGC公司；绵羊全血，购自兰州民海生物工程有限公司；Buffer、dNTPs、Taq酶、低分子量DNA Marker，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 样品来源 2018年3月—2019年2月在江苏泰州地区采集人源样本296份(257份为医院腹泻患者粪便样本、39份为脑脊液样本)、动物源样本544份(285份鸡群肛拭样本、259份羊群肛拭样本)、食品源样本503份，共1 343份样品进行沙门菌、弯曲菌、单核细胞增生性李斯特菌的检测。棉拭样品用Cary-Blair运送培养基运送，其余样品置于4 ℃冰盒6 h内送达实验室检测。

1.3 病原菌的分离

1.3.1 沙门菌的分离 腹泻患者的粪便样本按国标方法进行常规检验，主要步骤为：约10 g粪样于10 mL SC增菌液中37 ℃增菌18～24 h，WS平板分离培养24 h，疑似菌落接种TSI斜面培养18～24 h，可疑菌苔进行玻板凝集试验，阳性者做生化鉴定。鸡群泄殖腔样本接种5 mL TTB增菌液42 ℃培养24 h，科玛嘉显色培养基37 ℃分离培养24 h，挑取紫色单菌落纯培养后做生化鉴定。食源样本参照GB 4789.4—2010《食品微生物学检验 沙门菌检验》进行分离。

1.3.2 弯曲菌的分离 Carry-Blair培养基中的棉拭样本、食源样本1 g剪碎，加入9 mL布氏肉汤(含抗生素和生长促进剂)，厌氧培养罐42 ℃摇床培养24 h，CCDA平板42 ℃培养24～48 h，挑选湿润、灰白色、有金属光泽的菌落3～5个，溶于50 μL超纯水，隔水煮沸20 min后取出置于冰上，8 000 r/min离心5 min，取上清液进行PCR检测。

1.3.3 单核细胞增生性李斯特菌的分离 Carry-Blair培养基中的棉拭样本、食源样本1 g剪碎，加入9 mL LEB中培养24 h，OXFORD选择培养培养24 h， 挑选细小、湿润、黑色的疑似菌落BHI过夜纯培养，溶菌酶-蛋白酶K法提取菌液的基因组DNA进行PCR检测。

1.4 病原菌的鉴定

1.4.1 沙门菌的鉴定 纯培养物首先进行生化鉴定，包括糖发酵试验、枸橼酸盐利用试验、甲基红试验、硫化氢试验、尿素试验，生化鉴定阳性的菌株采用热裂解法制备菌株DNA模板后扩增保守基因invA， 目的扩增片段为284 bp。扩增体系25 μL，其中ddH2O 17.5 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、Taq酶2 μL、 10 μmol/L引物1 μL、DNA模板1 μL。扩增程序：93 ℃ 5 min；93 ℃ 30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.4.2 弯曲菌的鉴定 参照何蕊等[2]的方法，选取弯曲菌属16S rRNA基因、空肠弯曲菌mapA基因、结肠弯曲菌CeuE基因设计引物。PCR体系中各成分的量为：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 3 pmol，16S rRNA的引物分别为20 pmol，mapA引物，CeuE引物各为37.5 pmol，模板溶液2 μL，Taq酶0.2 μL。扩增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。空肠弯曲菌在857 bp 和589 bp处分别出现属特异性条带和种特异性条带，结肠弯曲菌在857 bp和462 bp处分别出现属特异性条带和种特异性条带。

1.4.3 单核细胞增生性李斯特菌的鉴定 参照周晓辉等[3]的方法，扩增Lm毒力基因溶血素基因hly，目的扩增片段850 bp。PCR体系中各成分的量：10×Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，dNTPs 5 pmol，hly引物各10 pmol，模板DNA 3 μL，Taq酶0.2 μL，去离子水14.8 μL。扩增程序：94 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。

2 结果

2.1 人源样本病原菌的监测 296份人源样本中39份为医院脑脊液样本，257份为医院腹泻患者的粪便样本。脑脊液样本未分离到单核细胞增生性李斯特菌，腹泻患者样本分离到沙门菌和弯曲菌共16株，阳性率为6.23%，其中沙门菌4株，阳性率为1.56%，空肠弯曲菌10株，阳性率为3.89%，结肠弯曲菌2株，阳性率为0.78%。124份5岁以下婴幼儿样品中分离到病原菌9株，阳性率为7.26%，其中沙门菌1株，阳性率为0.81%，空肠弯曲菌7株，阳性率为5.65%，结肠弯曲菌1株，阳性率为0.81%。133份6岁及以上腹泻患者样本中分离到病原菌7株，阳性率为5.26%，其中沙门菌3株，空肠弯曲菌3株，阳性率均为2.26%，结肠弯曲菌1株，阳性率为0.75%(见表1)。不同时期的样品监测结果显示，3～5月分离到沙门菌和弯曲菌各1株，阳性率为3.23%；6～8月分离到弯曲菌4株，包括3株空肠弯曲菌和1株结肠弯曲菌，阳性率为8.70%；9～11月分离到7株病原菌，包括1株沙门菌、1株结肠弯曲菌和5株空肠弯曲菌，阳性率为9.59%；12月到次年2月分离到3株病原菌，包括2株沙门菌和1株空肠弯曲菌，阳性率为3.95%(见表2)。

表1 不同年龄腹泻患者样本病原菌监测结果Table 1 The results of pathogenic bacteria in diarrhea patients of different ages

表2 不同时期人源样本病原菌监测结果Table 2 The results of pathogenic bacteria in human samples in different periods

2.2 动物源样本病原菌的监测 544份动物源样本中有259份为羊群肛拭样本，分离到3株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为1.16%，285份鸡群肛拭样本分离到病原菌52株，阳性率为18.25%。鸡群样本中病鸡样本59份，分离到病原菌20株，包括5株沙门菌、14株空肠弯曲菌和1株结肠弯曲菌，阳性率为33.90%；健康种鸡样本33份未分离到病原菌；健康雏鸡样本67份分离到病原菌9株，包括2株沙门菌和7株空肠弯曲菌，阳性率为13.43%；健康成年鸡样本126份分离到病原菌23株，包括5株沙门菌、17株空肠弯曲菌和1株结肠弯曲菌，阳性率为18.25%(见表3)。

表3 鸡群样本病原菌监测结果Table 3 The results of pathogenic bacteria in chicken samples

2.3 食源样本病原菌的监测 503份食源样本共分离到病原菌46株，包括15株沙门菌、8株空肠弯曲菌、3株结肠弯曲菌和20株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为9.15%。其中市场鸡肉样本75份，分离到病原菌15株，包括6株沙门菌、7株空肠弯曲菌、1株结肠弯曲菌和1株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为20%；市场鸡肉样本67份，分离到病原菌6株，包括4株沙门菌、1株空肠弯曲菌和1株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为8.96%；市场猪肉样本87份，分离到病原菌14株，包括4株沙门菌、1株结肠弯曲菌和9株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为16.09%；超市猪肉样本64份，分离到病原菌6株，包括1株沙门菌和5株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为9.38%；市场蔬菜样本63份，分离到1株结肠弯曲菌，阳性率为1.59%；市场淡水鱼虾样本76份，分离到2株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为2.63%；熟肉样本71份，分离到2株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为2.82%(见表4)。

表4 食源样本病原菌监测结果Table 4 The results of pathogenic bacteria in food samples

3 讨论

2018 年泰州市食源性致病菌的监测结果表明:沙门菌、弯曲菌和单核细胞增生性李斯特菌在自然界中广泛存在，人群、动物群和食品中均存在一定程度的感染或污染。沙门菌寄生于宿主肠道内，可引起家禽出现伤寒、副伤寒、鸡白痢等疾病，还可通过污染的肉类、禽蛋类、蔬菜等食物引起人沙门菌感染，沙门菌进入肠道后大量繁殖，引起肠黏膜发炎，大量活菌释放的内毒素可引起机体中毒。全球每年有超过 1亿人感染沙门菌，其中超过 15 万人会死亡[4]。作为人类感染性腹泻最为常见的肠道致病菌之一，至今已有2 500多种血清型被发现[5]。本试验在腹泻人群样本中分离到4株沙门菌，阳性率为1.56%。不同类型的鸡群样本中分离到12株沙门菌，阳性率为4.21%，病鸡样本的分离率最高为8.47%，其次健康成年鸡的分离率为3.97%，健康雏鸡的分离率为2.99%，健康种鸡由于长期净化的结果或者样品采集量不够大未分离到沙门菌。本次食品样本中共检出15株沙门菌，污染率为2.98%，沙门菌是引起当今全球食物中毒病例最多的致病菌[6]，食品污染不可忽视。本次监测到的沙门菌污染主要集中在肉制品，市场鸡肉污染率最高达8.00%，其次超市鸡肉为5.97%、市场猪肉为4.60%、超市猪肉为1.56%。从健康成年鸡为3.97%的分离率到市场鸡肉8.00%的污染率，提示了进一步加强运输管理和市场卫生检疫的必要性。

弯曲菌广泛分布于自然界，是许多畜禽的寄生菌，可引起动物腹泻、牛羊流产、雏鸡坏死性肝炎，此外，可通过动物、食物、水等传播并引起人的感染，导致人出现发热、急性肠炎、格林巴利综合征等疾病。弯曲菌是重要的腹泻病原菌之一，尤其引起婴幼儿腹泻[7]。本试验调查结果显示，5岁以下婴幼儿患者样本中空肠弯曲菌的阳性率达到5.65%，而6岁以上腹泻患者的阳性率为2.26%，有显著差异，这就进一步提示了5岁以下儿童是弯曲菌(尤其是空肠弯曲菌)的主要感染者或者是带菌者。不同时期人源样本致病菌的监测结果提示，夏季、秋季的感染率高于其他时期。人类弯曲菌主要来源于家禽，尤其是鸡群。鸡群285份样本监测结果显示，病鸡的阳性率最高，空肠弯曲菌阳性率达到23.73%、结肠弯曲菌阳性率为1.69%，健康雏鸡空肠弯曲菌的阳性率为10.45%，成年鸡空肠弯曲菌的阳性率为13.49%。鸡群中弯曲菌的来源及影响菌体定殖的因素主要包括其他动物(家畜、苍蝇、宠物等)、饲养人员、环境、设备、饮用水等，做好鸡场的环境管控、做好夏季的灭蝇工作、遵守生物安全程序、定期消毒运输包装箱等对于降低养殖环节弯曲菌的感染很有必要。503份食源样本空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的阳性率分别为1.59%、0.60%，市场鸡肉样本中空肠弯曲菌的污染率最高，达到9.33%，显著高于其他样本，显示鸡肉是食源性弯曲菌风险来源的主要食品品种和项目，加强禽类及禽肉产品的食品安全管理是控制弯曲菌感染的重要环节。超市冷冻鸡肉弯曲菌的污染率为1.49%，显著低于市场鸡肉的污染率，主要是因为弯曲菌对低温较为敏感，低于30 ℃便不再生长，因此冷冻处理是降低禽肉表面弯曲菌污染水平的一种实用且有效的方法，可通过低温储存、运输降低肉品表面弯曲菌数量。

单核细胞增生性李斯特菌是一种兼性胞内寄生菌，动物的感染主要与食用污染的饲料有关，症状以中枢神经系统感染为主，病初精神沉郁、食欲不振、发热，几天后会出现脑膜炎症状。病原菌可经过污染农场、食品加工、销售传染给人，引起免疫力低下人群如新生儿、老年人、孕妇等出现脑膜炎、败血症、流产及多器官功能障碍等，虽然发病率较低，但致死率可达20%～30%。在国内，单增李斯特菌暴发次数不多，多为零星散发，然而这一病原菌经常在各省市的市售食品中得到分离[8]。本试验从动物源259份羊群样本分离到3株单核细胞增生性李斯特菌，阳性率为1.16%。259份羊群样本中有68份采自小养殖户，而3份阳性样本均来自小养殖户，采样过程中发现小养殖户环境管理粗放，粪污处理不及时，场地没有定期消毒，存在羊与家禽混合饲养的情况；其余的191份羊群样品采自江苏某生态农业有限公司，该公司养殖场区污道、净道、排污、排水分离清晰，粪污处理设施、消毒设施齐全，饲料质量过关，未分离到单核细胞增生性李斯特菌。由此可见，养殖场环境的精细化管理、定期消毒是保证动物群健康的有效措施。食源503份样本中共分离到20株单核细胞增生性李斯特菌，污染率为3.98%。市场猪肉的污染率最高达10.34%，其次超市猪肉为7.81%、熟肉制品为2.82%、市场淡水鱼虾为2.63%、超市鸡肉为1.49%、市场鸡肉为1.33%。单核细胞增生性李斯特菌可通过食品引起人的感染，尤其是免疫力低下人群往往表现为中枢感染。与其他食源性人兽共患病原菌不同，单核细胞增生性李斯特菌在 4 ℃的条件下仍可生长繁殖,因此它是冷藏类食品中威胁人类健康的主要病原菌，其潜在的危害性应引起人们的足够重视[9]。