茵黄口服液的安全药理学试验

李紫元，肖洁怡 , 龙小铃，莫 蓝 , 梁伟燊，刘俊丹，邱文才，伦健炽，何永明，唐陆平

(佛山科学技术学院兽医系，广东 佛山 528000)

安全药理学主要研究药物在治疗范围或超出治疗范围剂量时，出现潜在的药物不良影响[1]，是新药临床前安全性评价的重要组成部分。一般设计3个剂量组(其中低剂量组应不低于临床拟推荐剂量、高剂量组应以不产生严重毒性反应为限)，原则上应与临床拟用途径一致，采用单次给药[2]。心血管系统、呼吸系统和中枢神经系统是维持生命的重要系统，临床前安全药理学试验必需完成对这些系统的核心组合观察[3]。茵黄口服液由茵陈和黄芩按2∶1比例组成，常规方法制备口服液，临床拟用于治疗畜禽药物性急性肝损伤。本文参照《兽用中药、天然药物安全药理学研究技术指导原则》对茵黄口服液的安全药理学进行试验。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 MC4000小动物无创血压分析仪，美国Hatteras公司；EMKA小动物无创肺功能检测系统，法国EMKA Technologies公司；YLS-1B多功能小鼠自主活动记录仪，山东省医学科学院设备站；XZC-5C小鼠转棒式疲劳仪，山东省医学科学院设备站。

1.2 主要试剂和药物 戊巴比妥钠(进口分装)；茵陈(批号20170525)购自北京本草方源药业集团有限公司；黄芩(批号70550601)购自北京三和药业有限公司。茵黄口服液小试产品，本实验室自制。

1.3 实验动物及饲喂 SPF级KM小鼠，体质量(20±2)g。所有动物雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(粤)2013-0002。高压灭菌全价颗粒饲料，由广东省实验动物中心提供；给料方式自由摄取。饮用水，瓶装蒸馏水，由动物饮水瓶自由摄取。垫料为消毒木屑，由广东省实验动物中心提供。

实验动物饲养管理的环境条件：屏障系统内饲养，温度20～25 ℃，湿度40%～70%，换气次数10～ 20 次/h，从购入日算作第1天，检疫与驯化期共为3 d。期间对外观、一般状态进行观察，待稳定后试验。

1.4 心血管系统、呼吸系统相关指标测定 KM小鼠随机分为4组，每组20只，雌雄各半，茵黄口服液按高剂量组[20 g/(kg·bw)]、中剂量组[10 g/(kg·bw)]、低剂量组[5 g/(kg·bw)]灌服，灌胃体积0.2 mL/(10 g·bw)，空白对照组灌服等体积的蒸馏水。分别使用MC4000无创血压分析仪和EMKA无创肺功能分析仪记录给药前(-1 h)、给药后(0、1、2 h和4 h)的血压、脉搏、呼吸频率、呼吸间隙和潮气量等相关指标[4-5]。

1.5 神经系统相关指标测定

1.5.1 对戊巴比妥钠阈剂量催眠作用的影响 KM小鼠数量、分组及给药方法同1.4，给药50 min后，4组小鼠均腹腔注射50 mg/(kg·bw)阈剂量戊巴比妥钠，出现翻正反射消失为入睡时间，从翻正反射消失至恢复时间为睡眠持续时间。记录每只小鼠睡眠时间[6]。

1.5.2 对戊巴比妥钠阈下剂量催眠作用的影响 KM小鼠数量、分组及给药方法同1.4，给药50 min后，4组小鼠均腹腔注射25 mg/(kg·bw)阈下剂量戊巴比妥钠，小鼠翻正反射消失1 min以上为睡眠，记录给药后30 min内睡眠小鼠只数。

1.5.3 对一般状态、自主活动的影响 KM小鼠数量、分组及给药方法同1.4，在给药后10、30 min和60 min，使用小鼠活动记录仪记录小鼠10 min内的活动次数，并对小鼠生理状态进行观察。

1.5.4 对机能协调运动的影响 筛选出在转棒式疲劳仪上运动3 min(16 r/min)不坠落的KM小鼠80只，分组及给药方法同1.4，于给药后50 min，使用转棒式疲劳仪(16 r/min)观察小鼠机能协调运动(1 min和3 min内的转棒坠落率)。

1.6 统计学方法 数据收集整理采用Excel表格，采用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行统计学处理。先对资料作一般描述性分析，计算各计量资料的平均数、标准差，计数资料用百分数(%)表示。计量资料先作正态性检验，符合正态分布及方差齐性采用单因素方差分析；非正态分布或方差不齐采用秩和检验。计数资料采用卡方检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 茵黄口服液对心血管系统的影响 结果见表1。茵黄口服液给药4 h后，高剂量组和低剂量小鼠的收缩压、舒张压显著低于对照组(P<0.05)；小鼠脉搏相同时间点各组之间比较均不具有显著性差异(P>0.05)。

2.2 茵黄口服液对呼吸系统的影响 结果见表2。茵黄口服液给药后，各组相同时间点的呼吸频率、潮气量比较均没有显著性差异(P>0.05)。各组的呼吸曲线正常。

2.3 茵黄口服液对神经系统的影响

2.3.1 对戊巴比妥钠阈剂量催眠结果的影响 小鼠入睡时间，茵黄口服液高剂量组为(4.05±1.40) min、中剂量组为(9.4±8.1) min、低剂量组为(9.00±6.79) min、对照组为(11.47±11.27) min，高剂量组较对照组显著减少(P<0.05)；睡眠维持时间，茵黄口服液高剂量组为(46.85±20.42) min、中剂量组为(38.26±19.22) min、低剂量组为(39.9±21.49) min、对照组为(32.58±23.09) min，高剂量组较对照组显著延长(P<0.05)。

2.3.2 对戊巴比妥钠阈下剂量催眠结果的影响 阈下剂量催眠率，高剂量组为10%(2/20)、中剂量组为5%(1/20)、低剂量组为10%(2/20)、对照组为0%(0/20)，组间比较差异无显著性(P>0.05)。

表1 茵黄口服液对小鼠收缩压、舒张压和脉搏的影响Table 1 Effect of Yinhuang oral liquid on systolic arterial pressure,diastolic arterial pressure and pulse in mice (n=20)

2.3.3 对一般状态、自主活动的结果 各组小鼠姿势、步态均正常，活动无异常，毛色光滑，无流涎、肌颤及瞳孔等变化。给药前1 h和给药后10、30 min和60 min的活动次数，高剂量组分别为(206.8±40.0)次、(129.9±56.1)次、(144.1±51.7)次和(134.8±45.5)次；中剂量组为(196.8±26.5)次、(166.1±38.9)次、(151.6±39.0)次和(158.9±36.2)次；低剂量组为(198.1±22.2)次、(156.4±42.0)次、(153.0±36.8)次和(149.3±42.9)次；对照组为(192.7±39.5)次、(158.3±28.4)次、(142.8±32.1)次和(143.1±39.2)次。各组相同时间点自由活动次数比较均无差异显著性(P>0.05)。

2.3.4 对机能协调运动的结果 高剂量组小鼠1 min转棒坠落率为10%(2/20)，对照组小鼠3 min转棒坠落率为10%(2/20)，其余组别和时间均为0%。各组小鼠的转棒坠落率相同时间点比较差异无显著性(P>0.05)。

3 讨论

3.1 茵黄口服液对心血管系统的影响 沈飞海等发现茵陈提取物灌胃对大鼠有一定的降血压作用，其机制与显著下调大鼠体内的血管紧张素Ⅱ和血清NO的水平有关[7]。茵陈中的香豆素化合物，静脉注射家兔，可显著降低血压，并且随着用药量的增加，血压下降程度和时间也有增加和延长[8]。黄芩苷有扩张血管，降低血压的作用，主要机制是通过阻滞平滑肌细胞膜上的电压依赖型钙通道和受体操纵型钙离子通道使细胞内的钙离子浓度升高[9]。另有研究表明，黄芩苷有排钠利尿的作用，减少外周血容量和心脏血输出量，使得血压下降。黄芩素不会影响正常大鼠的血压，对高血压大鼠有降压作用[10]。推测用药后4 h高剂量和低剂量组血压下降与茵陈中的香豆素和黄芩中的黄芩苷等的降压作用有关。中剂量组个别小鼠的血压较高(导致标准差明显偏高)，推测仪器通道本身存在的问题抑或尾套血压测试方法的问题[11-12]，未能体现出降压作用。是否如此，值得进一步探索。

表2 茵黄口服液对小鼠呼吸频率的影响Table 2 Effect of Yinhuang oral liquid on respiratory frequency of mice (n=20)

3.2 茵黄口服液对呼吸系统的影响 黄芩主入肺经，长于清肺热，为治疗肺热咳喘之要药；单用有效，即清金丸(《丹溪心法》)。黄芩对急性肺损伤有一定的治疗作用[13]，黄芩苷可通过调节TH1/TH2和Th17/Treg等通路治疗过敏性哮喘[14-15]。这提示黄芩对呼吸急促状态下的呼吸频率和潮气量可能有一定的负向调节作用。茵黄口服液各剂量组的呼吸频率、潮气量、呼吸节律与空白对照组相同时间点比较，差异没有显著性，且均在正常范围内[16]，这提示茵黄口服液在20 g/(kg·bw)范围内给药对正常动物的呼吸系统无明显影响。

3.3 茵黄口服液对神经系统的影响 黄芩中的黄芩苷和黄芩素均有镇静作用，并且对神经有一定的保护作用。黄芩苷对睡眠和觉醒有双向调节作用：光照期会抑制IL-1的活性减少慢波睡眠(SWS)，黑暗期会增强GABA(A)受体活性来增加SWS和快速眼动睡眠(REMS)[17]。黄芩素增加乙醚诱导的睡眠时间，药理活性依赖于GABA的非苯二氮卓部位[18]。戊巴比妥钠阈剂量催眠结果，茵黄口服液高剂量组小鼠的入睡时间显著减少、睡眠维持时间显著延长；戊巴比妥钠阈下剂量催眠结果，茵黄口服液各剂量组均有小鼠睡眠。这提示茵黄口服液可能具有镇静催眠作用，且其镇静催眠作用与方剂中的黄芩有关。

小鼠一般状态、自主活动的结果，同一时间点茵黄口服液各剂量组与对照组比较无差异显著性(P>0.05)，但均较给药前显著减少，这与我们前期研究结果类似[6]，原怀疑与测量时间选择有关(傍晚-深夜)，本次试验排除此因素；怀疑与小鼠适应周围环境和灌胃应激相关，需要做进一步的研究证明。

茵黄口服液对心血管系统、呼吸系统和神经系统安全药理性研究表明，发现该方剂有一定的降压作用，对神经系统有一定的镇静作用。