蒲公英水提物联合抗菌药对含CTX-M基因多重耐药大肠杆菌的体外抑菌效果研究

李 铮，李 崇，沈水宝，司红彬

(广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530003)

大肠杆菌是常见的条件致病菌，也是畜禽肠道微生物的重要组成部分，由于养殖业的关系，大肠杆菌可以长期与抗菌药物接触使得其比其他细菌更容易产生耐药性。这其中大肠杆菌最常携带的就是产超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum β-lactamases,ESBLs)耐药基因[1]。超广谱β-内酰胺酶有很多种不同的类型，其中最主要的类型有：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型。其中，CTX-M型是最新发现的也是传播最广的β-内酰胺类药物耐药基因类型，从1989年该耐药基因被首次发现，到2017年，已发现了超过190余种CTX-M的亚型在全球范围传播[2]。于是，治疗携带CTX-M耐药基因的致病性大肠杆菌成为养殖业的难题之一。

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)菊科，蒲公英属多年生草本植物，中药蒲公英是由蒲公英属植物的全草经炮制后制成的清热解毒类中药，呈干草状。其味苦，性寒，无毒，入肝经、胃经，具有良好的抑菌抗炎、利胆保肝、降血糖、降血脂[3]、抗氧化、抗肿瘤[4]等作用。研究发现，蒲公英成分复杂，但其中有效的抑菌活性成分大致包括以下几种：黄酮类、多糖类、酚酸类植物甾醇类、倍半萜内酯类[5]等。目前关于蒲公英抑菌效果的研究有很多[5-7]，但是很少有关于蒲公英联合抗菌药物抑菌的报道。本试验旨在研究蒲公英水提液联合多种抗菌药物对CTX-M型的产ESBLs大肠杆菌的体外抑菌效果，为中药蒲公英的研究和大肠杆菌疾病的治疗提供更多的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 中药蒲公英干草，购自广西太华药业有限公司；受试菌株由广西大学动物科学技术学院中兽医实验室分离保存；林可霉素、氟苯尼考、左旋氧氟沙星、痢菌净、加替沙星、阿奇霉素和链霉素等11种抗菌药均在有效期内，并根据需要配置成不同浓度的溶液；麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、LB肉汤等，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.2 蒲公英水提液的制备和抗菌药物的配置 称取干燥蒲公英中药100 g至烧杯中，加10倍的蒸馏水浸泡过夜。然后煮沸1 h，纱布过滤，逐次加入8倍、6倍的蒸馏水重复上述步骤，3次滤液合并、抽滤、浓缩至100 mL，此时蒲公英的浓度约为1 g/mL。根据药典用不同溶剂将阿莫西林、环丙沙星、左旋氧氟沙星、林可霉素、阿奇霉素、利福平、土霉素和链霉素配置成浓度为6 400 μg/mL的溶液；氟苯尼考配置成浓度为5 120 μg/mL的溶液；痢菌净和加替沙星配置成浓度为3 200 μg/mL的溶液。

1.3 大肠杆菌的分离及基因型鉴定 将30%甘油保存的菌株接种到 LB试管肉汤中震荡培养过夜，然后划线接种到伊红美蓝琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上，37 ℃ 培养16～18 h。参考孙燕杰等[1]设计的16S rDNA和CTX-M引物(见表1)进行疑似大肠杆菌菌株的PCR及琼脂糖凝胶电泳。PCR反应体系：Mix 12.5 μL；去离子水8.5 μL；上、下游引物各1 μL；菌液模板2 μL。PCR扩增条件：94 ℃，5 min；94 ℃,30 s；退火温度见表1，30 s；72 ℃， 1 min；循环30次；72 ℃，10 min。16S rDNA送至武汉金凯瑞生物有限公司测序。

表1 16S rDNA与CTX-M引物序列与退火温度Table 1 16S rDNA and CTX-M primer sequences and annealing temperature

1.4 菌悬液制备 从麦康凯培养基上挑取单个菌落于LB试管肉汤中，放入摇床37 ℃、220 r/min培养5 h，用LB肉汤培养基将菌悬液稀释至0.5麦氏比浊度。

1.5 蒲公英和抗菌药物对含CTX-M大肠杆菌最小抑菌浓度的测定 采用微量肉汤稀释法测定中药蒲公英和11种抗菌药对该大肠杆菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)，过程及结果判断严格按照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)标准(2017版)的方法进行。

1.6 蒲公英和抗菌药联合诱导细菌传代 将蒲公英水提液加入到LB肉汤中稀释为亚抑菌浓度，即1/2 MIC，加入适量菌悬液使细菌浓度达到106CFU/mL。将上述混合物加入到96孔板中，再加入抗菌药。使抗菌药的最终浓度为2倍MIC，蒲公英水提液的终浓度为1/2 MIC，此即为第1代，按同样的方法(不加菌悬液)配置第2、3代，其中细菌从前1代接种,记录各代的MIC。

1.7 蒲公英和抗菌药联合微量棋盘稀释法 将蒲公英和抗菌药分别做竖向和横向的倍比稀释，然后合并，再加入同体积的106CFU/mL菌悬液。药物的互相作用效应通过计算其最小部分抑菌浓度指数(Fractional inhibitory concentration indices,FICI)来进行判断，判断标准：当FICI≤0.5，为协同效应；当0.52，为拮抗效应。

2 结果

2.1 菌株形态特征 在麦康凯琼脂培养基上该菌株的形态为：玫红色圆形光滑菌落(见中插彩版图1A)。在伊红美蓝琼脂培养基上该菌的形态：株菌落中心为紫黑色，混合部分有绿色金属光泽的圆形光滑菌落(见中插彩版图1B)。菌株可认定为疑似大肠杆菌菌株。

图1 细菌在麦康凯培养基(A)和伊红美蓝培养基(B)上的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of bacteria on McConkey medium (A) and Eosin methylene blue medium (B)

2.2 菌株及基因型鉴定 PCR电泳结果显示，16S rDNA和CTX-M基因的片段长度与预期相同(见图2)，可确定该细菌含有CTX-M基因，同时，将16S rRNA测序结果于NCBI上进行比对分析，最后确定该细菌为含有CTX-M基因的大肠杆菌。

图2 大肠杆菌16S rRNA(A)及CTX-M(B)结果Fig.2 Results of Escherichia coli 16S rRNA (A) and CTX-M (B)M:DL-2 000 DNA相对分子质量标准； 1：空白对照； 2：受试大肠杆菌M:DL-2 000 DNA marker; 1:Blank control; 2:Tested E. coli

2.3 蒲公英及抗菌药物对大肠杆菌的MIC、传代及联合作用效果 由表2可知，蒲公英对该大肠杆菌的MIC值为250 mg/mL。该大肠杆菌对所选的阿莫西林、左旋氧氟沙星、林可霉素、利福平、土霉素等的MIC均≥1 600 μg/mL；对环丙沙星、痢菌净、加替沙星和阿奇霉素的MIC均≥200 μg/mL；但是对链霉素的MIC较小，为50 μg/mL。蒲公英和抗菌药联合诱导该大肠杆菌传代发现，痢菌净随着传代其MIC逐渐降低；阿莫西林、左旋氧氟沙星、氟苯尼考、阿奇霉素和利福平等随着传代其MIC只出现一次降低，且降低幅度不一；环丙沙星、加替沙星、土霉素和链霉素等随着传代其MIC出现升高现象。蒲公英和抗菌药联合棋盘发现，与传代结果相似，痢菌净、氟苯尼考、阿奇霉素和利福平等与蒲公英联用对该大肠杆菌呈相加作用；阿莫西林、左旋氧氟沙星、加替沙星、林可霉素和土霉素等与蒲公英联用对该大肠杆菌呈无关作用；环丙沙星和链霉素与蒲公英联用对该大肠杆菌呈拮抗作用。

表2 抗菌药的最小抑菌浓度及联合蒲公英的传代、棋盘结果Table 2 The minimum inhibitory concentration of antibacterial drugs and the results of the passage and checkerboard of the combination dandelion

3 讨论

由于抗菌药的大量使用和耐药质粒的快速传播使得大肠杆菌的耐药性也越来越严重，刘正明等[8]对内蒙古地区羊源大肠杆菌的耐药性研究和冯敏燕等[9]对山东省鸡源大肠杆菌耐药趋势的研究，共同说明了大肠杆菌的耐药性的严重不仅仅体现在耐药的种类上，同样也体现在抗菌药的浓度上。

中药在我国已经有上千年的使用历史，却没有发现存在细菌耐药的现象，有着巨大的研究潜力，而清热解毒药的抑菌效果研究很早以前就已经开始了，从1995年华娟等[10]用超声提取法研究了50多种不同中药对7种细菌的抑制效果；到2016年荣茜等[11]利用乙醇回流、超声波等提取方法研究了25种中药单独和联合使用抑制猪幽门螺旋杆菌的效果。这些研究都充分说明了中药即使从西医的角度研究，同样具有可观的效果。

蒲公英作为一种清热解毒药在本试验中的MIC值为0.25 g/mL，在生产中直接应用有限，但根据本实验室研究思路，可考虑与抗菌药物联用达到增强抗菌药物抑菌作用的效果，结果也显示蒲公英在浓度为0.125 g/mL时与痢菌净(浓度为6.25 μg/mL)、磺胺间甲氧嘧啶(浓度为25 μg/mL)、氟苯尼考(浓度为50 μg/mL)和利福平(浓度为800 μg/mL)联用对大肠杆菌的抑制效果呈相加作用，同时，这4种抗菌药联用蒲公英水提液传代可降低抗菌药MIC，说明4种西药联用蒲公英水提液可有效增加抗菌药的药效或降低大肠杆菌的耐药。