米和食用淀粉中椰毒假单胞菌酵米面亚种污染调查与风险分析

陈荣桥，陈汉金，胡均鹏，冼燕萍，杨静，王斌，朱文信，刘冬虹，侯向昶，刘春生，吴玉銮，周颖璇

（广州质量监督检测研究院，广州市食品安全风险动态监测与预警研究中心，广州市食品安全检测技术重点实验室，广东广州 511447）

椰毒假单胞菌酵米面亚种（Pseudomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans，又称椰毒伯克霍尔德菌[1]）是唐菖蒲伯克霍尔德菌（Burkholderia gladioli）的一种病原型，容易污染谷类发酵制品（酵米面、玉米淀粉、醋凉粉等）、银耳、木耳及薯类制品（马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等）[2]。椰毒假单胞菌酵米面亚种广泛存在于环境土壤中，生长繁殖温度为 30～36 ℃，最佳产毒温度为 26～28 ℃。米酵菌酸是椰毒假单胞菌酵米面亚种产生的主要外毒素，对人和动物有强烈的毒性作用，美国《食品毒理学》研究表明人体血液中米酵菌酸含量达到200～300 μg/L即可达到致死剂量，人群中毒事件反映经口摄入含31 mg米酵菌酸的食物可致死亡，米酵菌酸中毒死亡率高达40%～100%，且米酵菌酸耐热，一般烹调方法不能破坏其毒性[3,4]。

米酵菌酸中毒机理是抑制线粒体腺嘌呤核苷酸转位酶（ANT）而产生毒性作用[5,6]。发病潜伏期一般为30 min～12 h，少数长达1～2 d，中毒早期多为胃肠道刺激，表现为恶心、呕吐、腹泻等，病情进展迅速，严重发展为脑、肝、肾多器官功能衰竭[7,8]。由椰毒假单胞菌酵米面亚种污染食物而引发米酵菌酸中毒事件在我国时有报道，据不完全统计，自20世纪中期以来，报道的此类事件影响人数累计超过2000人，死亡人数超过900人，中毒食物有发酵变质的玉米制品、变质银耳和长时间泡发的木耳等，涉及省份包括东北三省、四川、云南、浙江、广西和广东等[2,9-12]。其中，2018年广东省河源市和东莞市也接连发生了因食用过期湿粉条而引起家庭米酵菌酸中毒事件[4,7]。由此可见，椰毒假单胞菌酵米面亚种污染及其毒素中毒事件已经危及人们身体健康和生命安全，应当提高重视程度。

本研究率先在我国南方部分省份的一些粮食加工制品生产企业进行调研并采集了米（大米和碎米）、食用淀粉（玉米淀粉、小麦淀粉和木薯淀粉）样品，同时也在市场上随机购买了一些大米样品，开展椰毒假单胞菌酵米面亚种及其毒素米酵菌酸污染摸查和风险分析研究。首次在4份进口碎米和1份国产碎米中分离鉴定出6株唐菖蒲伯克霍尔德菌，其中4株为产毒素的椰毒假单胞菌酵米面亚种（均源自进口碎米），有1份进口碎米同时分离出1株产毒菌株和1株不产毒菌株，在2份进口碎米中同时检出米酵菌酸；国产碎米中分离出1株不产毒株。研究表明进口碎米存在椰毒假单胞菌酵米面亚种污染的安全风险。

1 材料与方法

1.1 原料

2020年4～6月，从我国南方部分省份采集米和食用淀粉样品共129份，其中47份大米、18份碎米和64份淀粉样品（具体见表1，其中产地信息均为产品包装标识），样品采自粮食加工制品生产企业和广州本地超市或市场。采样时，为了避免二次污染，对于小包装规格的产品则整包购买，对于大包装规格的产品则从新开封的产品中取出适量样品后即装入无菌均质袋并密闭包装，每件样品至少500 g。

1.2 仪器和试剂

VITEK 2 Compact自动微生物快速检测系统，法国梅里埃公司；生物安全柜，Thermo scientific；高压灭菌锅（Hirayama HVE 50）；恒温培养箱，Binder；天平（PL6001E）；移液枪，transfepette；ACQUITYTM超高效液相色谱仪和Waters XevoTM TQ MS三重四极杆串联质谱仪，Waters公司。

GVC增菌液、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯葡萄糖半固体琼脂培养基、卵黄琼脂培养基和SS琼脂培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司；VITEK 2 Compact GN鉴定卡，法国梅里埃公司；玻璃纸和旋蒸仪，郑州长城科工贸有限公司；米酵菌酸标准品（1 mg/mL），Sigma Aldrich；甲醇和乙腈（HPLC级），德国Merck公司；甲酸（HPLC级），德国CNW公司；氨水（分析纯），广州化学试剂厂；MAX固相萃取小柱（6 mg/3 mL），Waters公司；超纯水（18.2 MΩ·cm），实验室Milli-Q自制。

1.3 实验方法

按照GB/T 4789.29-2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》对所有样品进行处理和分离菌株[13]，生化鉴定采用VITEK 2 Compact自动微生物快速检测系统，对经VITEK 2 Compact确认的唐菖蒲伯克霍尔德菌，进一步开展毒性试验，对产毒培养获得的毒素粗提液采用小白鼠灌胃进行毒力测定，同时测定米酵菌酸。

参考GB 5009.189-2016《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》的前处理方法[14]，建立了检测米酵菌酸的超高效液相色谱-质谱/质谱（UPLC-MS/MS）法，仪器检出限为0.3 μg/L。UPLC-MS/MS检测色谱条件：BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱程序为：0.0～3.0 min，50%～70% A，3.0～3.6 min，70%～95% A，3.6～5.5 min，95% A，5.5～5.6 min，95%～50% A，5.6～7.0 min，50% A；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。质谱条件：电离方式为电喷雾负离子（ESI-）模式；毛细管电压2 kV，锥孔电压10 V；去溶剂温度500 ℃；去溶剂气为氮气，800 L/Hr；锥孔气为氮气，50 L/Hr；监测方式：多反应监测（MRM），米酵菌酸和异米酵菌酸的特征离子对（m/z）均为485.3/397.3和485.3/441.3（定量），碰撞能分别为20 eV和10 eV。

1.4 数据处理

本文数据使用Origin 9软件作图，每项数据实验三次取平均值处理。

2 结果与讨论

2.1 米和食用淀粉的污染情况

本次实验共采集129份，发现大米和碎米存在唐菖蒲伯克霍尔德菌、类鼻疽伯克霍尔德菌和荧光假单胞菌污染（见表1）。其中，在4份进口碎米样品中检出5株唐菖蒲伯克霍尔德菌（4株为产毒菌株和1株不产毒菌株），即在 1份进口碎米样品中同时检出 1株产毒菌株和1株不产毒菌株；1份国产碎米中检出1株不产毒菌株。

表1 米和食用淀粉样品中细菌污染情况Table 1 Contamination of various samples of Bacteria

表2 疑似菌落在PDA平板和卵黄琼脂平板上形态特征[13]Table 2 Characteristics of suspected colonies on PDA plate and egg yolk agar plate

2.2 样品在不同分离平板上疑似菌落的形态特征及生化特性

2.2.1 在 PDA平板和卵黄琼脂平板上的菌落特征

样品加入GVC增菌培养液培养48 h后划线分离培养[13]，在 13个样品中发现疑似唐菖蒲伯克霍尔德菌株14株，其中在1个样品中发现了2株。14株疑似菌落在PDA平板和卵黄平板上呈现出5种形态特征，如表2、图1和图2所示。5种菌落形态特征与GB/T 4789.29-2003的菌落特征描述较相似[13]。

图1 PDA平板上菌落特征Fig.1 Characteristics of colony on PDA plate

图2 卵黄琼脂平板上菌落特征Fig.2 Characteristics of colony on egg yolk agar plate

2.2.2 疑似菌落的生化特性

将上述5种类型菌落在卵黄琼脂培养基上培养48 h后，挑取典型单一菌落接种PDA平板培养24 h，然后用VITEK 2 Compact生化鉴定分析，具体的鉴定结果见表3。

表3 类型1～5的生化反应结果Table 3 Biochemical reaction results of type 1～5

注：当生化反应结果稍低于阈值时显示为弱阴性（-），当生化反应结果稍高于阈值时显示为弱阳性（+）。

鉴定结果表明，3号和4号菌株为唐菖蒲伯克霍尔德菌，1号菌株为类鼻疽伯克霍尔德菌，2号菌株为荧光假单胞菌，5号菌株未能鉴定出细菌种类。从生化反应特性上看，类鼻疽伯克霍尔德菌和唐菖蒲伯克霍尔德同属于伯克霍尔德菌属，故两者的生化差异不大，主要区别在于唐菖蒲伯克霍尔德菌可利用侧金盏花醇(ADO)，类鼻疽伯克霍尔德菌可利用D-纤维二糖(dCEL)、D-麦芽糖(dMAL)、蔗糖(SAC)以及 D-海藻糖(dTRE)；荧光假单胞菌在生化反应上大部分和唐菖蒲伯克霍尔德菌类似，主要区别在于D-甘露醇(dMAN)、L-脯氨酸芳胺酶(ProA)和D-山梨醇(dSOR)；未能鉴定的菌株生化反应与唐菖蒲伯克霍尔德菌的也大部分相似，也有可能是伯克霍尔德菌属中的一种。

2.3 唐菖蒲伯克霍尔德菌的毒性试验

2.3.1 毒力测试

将鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德菌的6株菌株，分别编号为S1、S2、S3、S4、S5和S6，其中S2和S3为同 1份碎米样品分离出的2株菌株（见表 4）。按照GB/T 4789.29-2003进行产毒培养，提取粗毒素，分别对体重18～20 g的小白鼠经口灌胃[13,15,16]。菌株S3和S6的粗毒素灌胃的小白鼠均没有死亡，菌株S1、S2、S4和S5的粗毒素灌胃的小白鼠均在24 h内死亡，表明菌株S3和S6为不产毒株，菌株S1、S2、S4和S5为产毒株。

表4 S1-S6培养物中米酵菌酸的检测结果Table 4 Detection results of Bongkrekic acid in S1-S6 culture

2.3.2 培养物中米酵菌酸的测定

将6株唐菖蒲伯克霍尔德菌的产毒培养物检测米酵菌酸（见表4），其中S1、S2、S4和S5的米酵菌酸含量在162.60～255.90 mg/kg，证实这4株为产毒株；S3和S6的培养物未检出米酵菌酸，证实为不产毒株。米酵菌酸标准溶液（a）和菌株S1粗毒素（b）的提取离子色谱图见图 3，可见，椰毒假单胞菌酵米面亚种产的毒素包括米酵菌酸和异米酵菌酸，有文献报导异米酵菌酸的毒性约为米酵菌酸的1/2～1/4[17,18]，由于尚无异米酵菌酸标准品售卖，本研究将（米酵菌酸峰面积+异米酵菌酸峰面积）与米酵菌酸标准品峰面积比较定量，且经实验验证，与将米酵菌酸和异米酵菌酸合成单峰的定量结果一致。

2.4 米和食用淀粉中米酵菌酸的测定

图3 米酵菌酸标准溶液（a）、椰毒假单胞菌毒素提取物（b）、阳性大米样品（c和d）、阳性碎米样品（e和f）的提取离子色谱图Fig.3 Extraction ion chromatograms of bongkrekic acid standard solution (a), toxin extract of Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans (b), positive rice samples(c and d), positive broken rice samples (e and f)

129份米和食用淀粉样品中，有2份大米和2份碎米（表4中碎米2和碎米4）检出米酵菌酸，含量分别为2.70、0.70、2.40和1.00 μg/kg。在检出米酵菌酸的2份大米中并未检出椰毒假单胞菌酵米面亚种，可能是由于菌在大米中分布极不均匀，且样品含有大量霉菌，霉菌与椰毒假单胞菌酵米面亚种生长条件基本一致，但是霉菌生长速度快，PDA平板培养时霉菌快速生长并基本铺满整个平板，难以辨别椰毒假单胞菌酵米面亚种菌落；检出米酵菌酸的2份碎米同时也检出了椰毒假单胞菌酵米面亚种，米酵菌酸含量虽然很低，但是表明菌已经在产毒，存在安全风险。

阳性大米（c、d）和阳性碎米（e、f）的提取离子色谱图见图 3，均包含了米酵菌酸和异米酵菌酸 2个峰。

3 结论

本研究主要针对食品工业中常用的米和食用淀粉样品进行椰毒假单胞菌酵米面亚种污染风险摸查。结果发现，首次在4份进口碎米和1份国产碎米中分离鉴定出6株唐菖蒲伯克霍尔德菌，在碎米样品中的检出率为27.78%（5/18）；经过毒性试验，其中4株证实为产毒素米酵菌酸的椰毒假单胞菌酵米面亚种，均源自4份进口碎米（其中2份碎米检出米酵菌酸），占进口碎米样品的 23.53%（4/17）。试验研究表明进口碎米存在椰毒假单胞菌酵米面亚种污染风险。碎米是一些粮食加工制品生产企业的原料，如果存放不当，尤其是湿热季节，容易为椰毒假单胞菌酵米面亚种的生长繁殖和产毒素提供条件，而目前相关标准和规范并没有将该菌纳入碎米安全指标进行监测，企业在采购使用碎米时对此风险也处于未认知状态，这有可能导致源头污染风险传递至下游各个环节，因此，建议监管部门打好相关防控组合拳，企业加强相关防控，共同有效预防由该菌引起的食物中毒事件发生。