不同抗生素参与下呋喃唑酮代谢物在鲫鱼体内的残留消除规律

方双琪，张帅，陈艳，张小军,3，梅光明,3

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山 316021）（2.浙江省海洋大学食品与药学学院浙江省海洋生物医用制品工程技术研究中心，浙江舟山 316021）（3.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316021）

抗生素是一种通过干扰细胞发育功能而达到抑菌或杀菌效果的化合物[1]，在水产养殖过程中，抗生素曾被当做渔药和饲料添加剂使用，具有防治细菌性疾病、提高饲料利用率及促进生长等一系列作用[2]。近年来，由于抗生素不合理使用导致细菌的耐药性不断增强以及水产品中的药物残留问题日益严重，抗生素逐渐被限量或禁止在水产养殖中使用。但现代化高密度、集约化的工厂化养殖使得水产品病害情况日益多发，为了挽回经济损失，化学抗生素类药物仍被一些养殖户非法使用，甚至多种抗生素联合使用来达到更好的治疗效果。因作用机制的不同，抗生素类药物联合使用时经常产生药物相互作用，导致药效的增强或降低，影响药物的代谢甚至引起毒副作用[3]，因此，研究抗生素之间联合使用时药物在机体内的消除过程及影响很有必要。

呋喃唑酮（Furazolidone）是一种具有5-硝基呋喃环基本结构的广谱抗菌药物[4],曾因高效的抗菌性和相对低廉的成本被广泛用作兽药或饲料添加剂以治疗人工养殖动物如鱼、虾、猪、鸡等的细菌性疾病。众多研究表明，呋喃唑酮在机体内几个小时便能全部代谢结束，但其代谢产物3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）却能以蛋白结合态的形式在体内稳定而持久的存在，具有潜在的三致作用（致畸、致癌、致突变）[5]。因此，为了确保动物源性食品安全并防止呋喃唑酮危害人类健康，许多国家逐渐禁止在禽畜及水生养殖动物中使用呋喃唑酮[6]。目前，对于呋喃唑酮的研究通常集中其原药和代谢物在水产动物体内的代谢上，但是关于抗生素药物对呋喃唑酮代谢物残留消除影响的报道仍然少见。本实验选择磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）、土霉素（Oxytetracycline）和恩诺沙星（Enrofloxacin）三种常见的抗生素类渔药与呋喃唑酮联合使用，以鲫鱼为研究对象，模拟网箱养殖，探讨这三种抗生素类渔药对呋喃唑酮代谢物在鲫鱼体内的残留消除的影响，为禁用药物的研究提供更多的参考，进而推动养殖业健康发展，保障消费者身体健康。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验中使用的健康鲫鱼购于浙江省舟山市临城老碶农贸菜场，体重150±10 g，体长16±2 cm。经随机抽样检测，鲫鱼体内不含呋喃唑酮原药及其代谢物。选用经氧气泵24 h曝气去氯处理的自来水作为实验用水，水温22±1 ℃，pH=7。实验前将鲫鱼放在带有增氧泵的橘黄色聚乙烯养鱼缸中暂养3 d，使其适应养殖环境，挑选个头均匀，外观健康的鲫鱼进行实验。

1.2 药品与试剂

呋喃唑酮，质量分数≥99%，由浙江省海洋水产研究所提供；呋喃唑酮代谢物标准品（AOZ），质量分数≥99.80%，美国Sigma公司；呋喃唑酮内标AOZ-D4，质量分数≥99.80%美国 Sigma公司；乙酸铵、2-硝基苯甲醛、甲醇、甲酸为色谱纯，乙酸乙酯、盐酸、二甲基亚砜、磷酸氢二钾为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水。

1.3 仪器与设备

ACQUITY型高效液相色谱仪，美国Waters公司；Quattro Preemier XE型串联三重四级杆质谱仪，美国Waters公司；LPD2550型多管涡旋混合仪，莱普特科学仪器有限公司；AvantiJXN-30型贝克曼离心机，库特尔商贸有限公司；ZD-85型恒温振荡器，常州国华电器有限公司；Nitrogen Evaporator 112型氮吹仪，美国Organomatio公司；微孔滤膜（0.22 μm），津腾。

1.4 实验设计

鲫鱼暂养3 d后，按每组15～20尾的数量随机分为5组（A0～A4），分别饲养在150 L聚乙烯养鱼箱中。A0为空白对照组，A1为呋喃唑酮单独给药对照组，A2为土霉素-呋喃唑酮联合给药组，A3为恩诺沙星-呋喃唑酮联合给药组；A4为磺胺间甲氧嘧啶-呋喃唑酮联合给药组。实验组A1-A4均采用药浴方式给药。实验前呋喃唑酮、土霉素、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶分别用乙腈、盐酸、醋酸、氢氧化钠助溶后再泼洒到养鱼箱中，且每个养鱼箱水体中的单个药物质量浓度均为 100 μg/kg。

为避免呋喃唑酮见光分解，药浴在晚上进行，药浴时长均为12 h，水温22±1 ℃。药浴结束后彻底换清水，且分别于药浴结束后的0、5、10、48、96 h时间点在实验组中随机选取3条鱼，作为3个平行样品。将鲫鱼解剖，取其背部肌肉、肾脏、肝脏，置于-18 ℃冰箱保存，待HPLC-MS/MS分析。

1.5 鲫鱼体内AOZ的提取与净化

取肌肉样品2.0±0.10 g，肝脏、肾脏各1±0.10 g于50 mL离心管中，加入100 ng/mL的内标工作液0.10 mL，涡旋混合50 s后加入5 mL 0.20 mol/L盐酸溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，放入气浴振荡器37 ℃避光衍生16 h。

取出离心管放置冷却到室温，加入1 moL/L磷酸氢二钾溶液4.5～5 mL，调节pH至7.0～7.5；加入8 mL乙酸乙酯提取，涡旋振荡5 min，再6500 r/min 6 ℃低温离心6 min；取上清液40 ℃下氮气吹干。肌肉残渣用1.0 mL甲醇水溶液（1:9）溶解，振荡后经0.22 μm有机滤膜过滤至进样瓶，待测；内脏残渣加入 1 mL正己烷溶解油脂后加入甲醇水，振荡20 s，4500 r/min 4 ℃再次低温离心5 min，取下层溶液过滤膜，待测。

1.6 检测方法

1.6.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC®BEHC18柱（2.1 mm×50 mm×1.7 mm）；样品室温度10 ℃；柱温40 ℃；进样量5 μL；流速0.2 mL/min；流动相A为包含0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸铵的溶液，B为甲醇，梯度洗脱程序见表1。

表1 流动性梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of the mobile phase

1.6.2 质谱条件

离子化模式：电喷雾电离源（ESI+）；离子源温度：120 ℃；扫描模式：多反应监测（MRM），多反应质谱监测实验条件（例如母离子，产物离子，锥电压和碰撞能量）列于表2。

表2 MRM模式下质谱测定的特征离子Table 2 Characteristic ions of mass spectrum determination in MRM mode

1.7 标准曲线绘制

分别准确移取10 ng/mL标准工作液0.10、0.5 mL，100 ng/mL标准工作液0.10、0.25、0.50 mL和1 μg/mL标准工作液0.10 mL于6个离心管中，除不加样品外，按1.5步骤操作，步骤1.6的仪器条件进行测定。采用内标法绘制标准曲线，以分析物与内标物峰面积比值为纵坐标，分析物质量浓度为横坐标进行线性回归，得到回归方程和相关系数R。

1.8 回收率与精密度

将呋喃唑酮代谢物标准品添加到鲫鱼的空白肌肉，肝和肾样品中以制备3个浓度样品，分别为1.0、5.0、10.0 μg/kg。按照1.5.1进行样品处理后，步骤1.6进行测定，每个添加水平做三个平行，每个平行分别在一天内重复进样3次。

1.9 数据处理

药时曲线通过Origin 8.5进行绘制。AOZ的平均消除速率v计算公式参照刘书贵等[7]，公式为：

其中：Mmax、Mmin为消除过程中 AOZ残留质量浓度的最大值和最小值；t1、t2为药物浓度达到最大和最小值所需要的时间。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线与灵敏度

AOZ标准溶液衍生化后测定得到的标准曲线表明：AOZ在1.0～100.0 ng/mL浓度范围内，线性关系良好，相关系数为 0.9999，线性方程为 y=0.36078x+0.06546

最低检测限为三倍基线噪音的药物质量比，定量限为十倍基线噪音药物质量浓度。该测定方法对AOZ的检测限（S/N＞3）为0.25 μg/kg，定量限（S/N＞10）为 0.5 μg/kg。

图1 单独和联合给药下鲫鱼体内各组织中AOZ的药时曲线Fig.1 The drug-time curve of AOZ in various tissues of crucian carp under single and combined administration

2.2 回收率与精密度

本试验条件下，以1.0、5.0、10.0 μg/kg为三个添加水平，每个水平测定三次，测定得到 AOZ在鲫鱼各组织中的回收率为 105%～108.60%，相对标准偏差为3.60%～7.80%。

2.3 给药剂量及方式

随着水产品质量安全监管力度的不断加大，各类禁用或限量抗生素均被列在水产品农兽药残留检测名单中，即使养殖户违法使用这些化学抗生素也不再高浓度给药，为了切合实际养殖情况，本实验选择 100 μg/kg进行低剂量给药。同时为了避免注射给药造成鱼体损伤以及拌饲投喂个体受药不均匀的情况，试验采用药浴给药的方式，模拟网箱养殖，药浴给药全程在水箱中进行，鱼体呼吸没有障碍，身体刺激小，每条鱼都能在健康状态下均匀给药，且在一定范围的药浴时间内，鱼体药物残留量与药浴时间呈正相关。

2.4 AOZ在鲫鱼组织中的分布与消除规律

鲫鱼在每种药物浓度100 μg/kg的水体中连续药浴12 h后，对照组（A1）和三组联合给药组（A2～A4）鲫鱼体内AOZ的分布和残留情况如图1所示。从图1中可以看出，药浴结束0 h后，对照组和联合给药组鲫鱼体内肾脏、肝脏、肌肉组织中的 AOZ就已经被检测出来，且在消除时间0～96 h内，各给药组鲫鱼体内三种组织中 AOZ的残留量呈现相似的变化趋势。在消除实验的前期阶段，给药组中的 AOZ在鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中的含量随着消除时间的增加都表现出波动下降的趋势；消除48 h之后三种组织中的AOZ的质量浓度开始缓慢衰减；停药96 h后，对照组及联合给药组鲫鱼肝脏、肾脏和肌肉中仍然有大量 AOZ残留，分别为6.62、8.95、1.32 μg/kg（A1组）；9.80、13.28、2.16 μg/kg（A2组）；11.8、12.30、2.94 μg/kg（A3组）；14.90、8.21、5.80 μg/kg（A4组）。且无论是对照组还是联合给药组中，鲫鱼各组织中的最大残留浓度均表现为肾脏＞肝脏＞肌肉。

2.5 三种抗生素对鲫鱼体内AOZ残留量的影响

表3为消除过程中单独和联合给药下AOZ在鲫鱼各组织中的最大残留浓度（Cmax）及对应时间（Tmax）。由表3可知，药浴结束后0 h，呋喃唑酮对照组（A1）鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中 AOZ的含量便达到最大值，分别为 88.87、59.20、14.91 μg/kg。而土霉素-呋喃唑酮组（A2）鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中AOZ的含量在5 h达到最大值分别为165.40、125.29、28.69 μg/kg，大约相当于对照组的 1.86、2.11、1.92倍；恩诺沙星-呋喃唑酮组（A3）鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中AOZ的含量分别在0、10和10 h达到最大值，分别为46.70、41.64、9.69 μg/kg，仅约为对照组的 0.53、0.70、0.65倍。磺胺间甲氧嘧啶-呋喃唑酮组（A4）鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中的AOZ含量也在0h达到最大值，分别为 90.20、70.95、18.30 μg/kg，与对照组相比也有升高但差异不大。

研究表明，联合用药引起的药物相互作用会表现为胃肠道吸收的相互作用、竞争血浆蛋白结合点、诱导或抑制肝药酶[8]、影响肾脏排泄等[9]，从而导致药物或其代谢物在人体组织中残留浓度和代谢的变化。例如青霉素与丙磺舒联合使用后，丙磺舒为酸性药物，可以抑制肾小管对青霉素的分泌从而使得青霉素的排泄减少、血药浓度增加[10]；红霉素和地高辛合用时，红霉素会改变胃肠道的菌群，增加地高辛的血药浓度并提高其生物利用率[11]。本实验下，四种药物经药浴方式对鲫鱼进行给药，药物经鲫鱼皮肤和鳃吸收进入体循环，实验结果表明，土霉素-呋喃唑酮组及恩诺沙星-呋喃唑酮组中AOZ在鲫鱼组织中达峰时间与对照组相比有明显不同，这可能是因为土霉素、恩诺沙星一定程度上延缓了鲫鱼体内 AOZ的代谢；此外土霉素-呋喃唑酮组中达峰浓度与对照组相比显著增加，而恩诺沙星-呋喃唑酮组明显降低，说明这两种抗生素影响了呋喃唑酮原药在鲫鱼体内的吸收及分布，改变了呋喃唑酮代谢物 AOZ在鲫鱼组织中的浓度；但土霉素、恩诺沙星具体通过哪种作用方式影响鲫鱼体内AOZ的残留浓度暂不明确，还需进一步研究。

表3 0～96 h内鲫鱼组织中AOZ的最大残留浓度及对应时间Table 3 The maximum residual concentration and corresponding time of AOZ in crucian carp tissues within 0～96hours

2.6 三种抗生素对鲫鱼体内AOZ消除的影响

表4为鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中AOZ的平均消除速率。表4可知，不同抗生素参与下AOZ在鲫鱼体内的平均消除速率也存在显著差异。其中对照组（A1）鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中 AOZ的平均消除速率为0.86、0.52、0.14 μg/(kg·h)；与对照组相比，恩诺沙星-呋喃唑酮组（A3）与磺胺间甲氧嘧啶-呋喃唑酮组(A4)鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中AOZ的平均消除速率均有不同程度的降低，分别为 0.36、0.31、0.03 μg/(kg·h)和 0.78、0.41、0.13 μg/(kg·h)，这可能是因为恩诺沙星及磺胺间甲氧嘧啶对鲫鱼肝脏的肝微粒体酶活性产生了抑制作用，且两种药物对 AOZ消除的抑制能力不一样。肝微粒体酶是药物代谢过程中的催化剂[12]，它的主要成分是细胞色素 P450（CYP450），李国昌等[13]表明，CYP450酶在肝脏中的活性对药物代谢起决定性作用，与药物的清除率呈正相关。贾娴等[14]分别单次及连续三天对鲫鱼腹腔注射恩诺沙星 3 mg/kg、30 mg/kg，然后在给药24 h后对鲫鱼体内氨基比林 N-脱甲基酶（APD）、红霉素 N-脱甲基酶（ERND）、7-乙氧基异吩噁唑酮-O-脱乙基酶（EROD）、7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶（ECOD）及苯胺-4-羟化酶（AH）进行活性测定，发现实验组中这五组种肝药酶活性明显下降，恩诺沙星对鲫鱼体内的肝微粒体酶具有抑制作用；丁同贵等[15]也指出磺胺类药物能够抑制肝药酶活性，这与本实验推论一致。

此外，与其他两种抗生素参与下 AOZ消除速率的变化不同，土霉素—呋喃唑酮（A2）组鲫鱼肾脏、肝脏、肌肉中 AOZ的平均消除速率与对照组相比明显升高，分别为1.71、1.17、0.31 μg/(kg·h)，这可能与其残留浓度的升高有关，但据临床研究报道，土霉素对肝脏的肝药酶也有抑制作用[16]，与本实验结果不一致，可能是因为本实验的给药浓度太低，土霉素未对鲫鱼的肝药酶的活性产生影响。

表4 鲫鱼组织中AOZ的平均消除速率Table 4 The average elimination rate of AOZ in crucian carp tissue

3 结论

综上所述，AOZ在鲫鱼体内难消除，且三种抗生素分别与呋喃唑酮联合用药下，AOZ在鲫鱼体内表现不同的残留消除规律，其中，土霉素能够提高 AOZ在鲫鱼体内残留浓度；恩诺沙星虽然能减少 AOZ在鲫鱼体内的残留浓度却使其代谢变慢，AOZ在鲫鱼体内的残留时间延长；磺胺间甲基嘧啶对 AOZ的残留量和平均消除速率分别有增加和延缓的作用但影响不大。本实验的联合用药是在低浓度下进行，三种抗生素在高浓度下与呋喃唑酮联合使用对 AOZ残留消除的影响还有待探讨。本研究为水产品质量安全监管和渔药残留研究提供了理论基础。