气相色谱-串联质谱法测定生姜中的黄樟素

韩梅，侯雪，贺光云，邱世婷，王悦涵，邹平

（1.四川省农业科学院分析测试中心，农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（成都），四川成都 610066）

（2.乐山市农业科学院，四川乐山 614200）

黄樟素（Safrole）又称黄樟油素、黄樟脑，是一种植物毒素，天然存在于姜、肉桂等天然芳香植物和樟属类植物中，是许多食用天然精油如黄樟精油、八角精油和樟脑油的主要成分[1,2]。黄樟素不溶于水，但很容易与氯仿，乙醚和其他非极性有机溶剂混合。黄樟素香味物质属于具有致癌性的烷基苯类化合物，近年来有研究表明，黄樟素能在肝组织中形成黄樟素-脱氧核糖核酸（DNA）加合物，食物中黄樟素的含量在0.5%以上时引起肝细胞瘤，对人体有一定的毒副作用，易诱发基因突变和肝损伤，甚至肝癌，是消化系统、血液系统、泌尿系统的强致癌物[3,4]。摄入足够剂量的黄樟脑可引起氧化应激，在食品加工过程中对含黄樟素的食物可采取干燥或蒸煮方式来消除或降低黄樟素的含量[5,6]。另有研究表明，含有黄樟素的树皮精油可对水产养殖具有防腐作用[7]。

目前文献报道黄樟素的检测方法主要是通过气相色谱法（Gas chromatography，GC）[8,9]，液相色谱法（Liquid chromatography，LC）[10]，液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[11]，气相色谱-质谱法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[12-15]，气相色谱-串联质谱法（Gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[16-20]对黄樟素进行分析检测。其中大部分都是对香精香料和烟草进行检测的。而对于生姜中的黄樟素检测仅有少量文献报道，结果中并未指明生姜中黄樟素具体含量[17]。目前我们国家标准在食品中黄樟素检测分析方法暂为空白。为了控制天然植物或精油中污染黄樟素，欧盟规定了天然食品中黄樟素的最高残留水平，其中调味料及调味酱为25 mg/kg[21]。此外在我国，黄樟素属于第一类易制毒化学品，属于管制类化学品[22]，因此为保障我国食品安全，建立一种食品中黄樟素的分析方法是非常必要的。

本研究针对生姜基质的复杂性，在优化前处理条件及仪器参数的基础上，建立固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定生姜中黄樟素的方法，对方法的实用性进行了验证，适用于生姜样品中黄樟素的筛查。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄樟素标准品（纯度大于99.9%），迪马公司产品；农药标准品购于农业部环境保护科研监测所（天津）；氯化钠（NaCl），上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水为纯净水，由 Milli-Q超纯水仪制备；乙腈、甲苯、正己烷、丙酮均为色谱级试剂，美国Thermo Fisher Scientific有限公司。

1.2 仪器与设备

三重四极杆气相色-谱质谱联用仪 GCMSTQ8040，日本岛津公司；涡旋混匀器，德国 IKA VORTEX3；TGL-16LM高速离心机，湖南星科科学仪器有限公司；AE240电子天平，瑞士Mettler公司；旋转蒸发仪，德国IKA R60。

生姜样品：采购于当地市场或生产基地。

1.3 标准溶液配置

准确称取一定量的黄樟素标准品，用丙酮溶解并定容于25 mL的容量瓶，配制质量浓度为200 μg/mL的标准储备液，于-18 ℃保存。再用丙酮稀释成 2 μg/mL的标准工作液。临用时，移取适量的标准工作液用空白样品基质提取液配制系列浓度的基质匹配标准工作溶液，现用现配。

1.4 样品前处理

准确称取10.0 g试样于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋混匀2 min后加入3 g氯化钠，涡旋混匀2 min，8000 r/min离心5 min。吸取5 mL上清液于10 mL比色管中。用5 mL乙腈-甲苯预洗固相萃取柱，弃去流出液。下接250 mL锥形瓶，放入固定架上。将5 mL待净化试样倒入固相萃取柱中，再用5 mL乙腈-甲苯溶液洗涤，并将洗涤液移入柱中，重复5次。收集上述所有流出液于250 mL锥形瓶中，40 ℃水浴中旋转浓缩至近干。加入2.5 mL正己烷-丙酮复溶，用于测定。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

SH-Rxi-5SilMS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气（纯度＞99.99%）；恒流模式，流速1.69 mL/min；进样方式不分流，进样量1.0 μL，进样口温度250 ℃；程序升温，50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至125 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃保持1.5 min。

1.5.2 质谱条件

表1 化合物的质谱参数Table 1 MS parameters of compounds

接口温度300 ℃，离子源温度230 ℃；电离方式为电子轰击电离源（EI），电子轰击能量70 eV，扫描方式：多反应监测(MRM)模式；碰撞气Ar；碰撞室压力239 Pa。黄樟素的保留时间和特征离子见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

试验采用 SH-RXI-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），通用型色谱柱适用于半挥发物质，酚类化合物，胺，溶剂残留，滥用药物，农残，溶剂残留，PCB同系物等的分析，是一款惰性非常高的GC-MS低流失色谱柱，可耐温度达350 ℃。实验过程中通过调整色谱参数，使仪器的灵敏度、稳定性和分离效率均处于最佳状态，并获得满意的分离效果。经过多次试验，确定色谱升温程序如1.5.1节所述。

2.2 质谱优化

按默认仪器工作条件对黄樟素基质标准溶液采用全扫描模式进行扫描，通过NIST谱库检索确定其保留时间；根据黄樟素的一级谱图选取响应值高、特征性强的离子作为母离子，然后采用产物离子扫描模式，将其母离子打碎以获得二次碎裂产生的子离子。通过优化碰撞能量对母离子进行碰撞解离，选择丰度值大、特征性强、灵敏度高的离子作为子离子。最后将选定的母离子对和子离子对在MRM模式下进行检测，其中响应强度高一组离子对为定量离子对，其他为定性离子对。黄樟素EI-MS谱图见图1。因分子式中含有苯环基团，二级碰撞过程中产生的质荷比为77的碎片离子容易出现干扰情况，所以不选77的离子碎片为子离子。同时，生姜是一种基质成分复杂的物质，为确保准确定性，本次试验选用多对离子定性定量。因而实验选用母离子m/z162，子离子m/z161、131、104、103。黄樟素基质标液总离子流色谱图见图2。

图1 黄樟素的EI-MS谱图Fig.1 EI-MS spectrum of safrole

图2 黄樟素基质标液总离子流色谱图(50 μg/kg)Fig.2 Total ion current chromatogram of safrole matrix standard solution (50 µg/kg)

2.3 前处理的优化

本试验的样品为生姜鲜样，含水分。本实验考察了乙腈，乙酸乙酯，乙醇作为提取溶剂时生姜中黄樟素的提取效率。生姜中含有水分，乙醇提取目标物后无法准确定量。乙酸乙酯在提取过程中极易挥发，有刺激性气味，回收效果也不显著。乙腈有优良的溶剂性能，对色素、脂肪等非极性成分的提取能力较弱，且对目标农药的干扰性小，最适宜于萃取极性范围较宽的多种农药。结果表明，乙腈的提取效率最高，乙腈干扰较之前两种试剂也少，因此本实验最终选用乙腈作为提取剂。生姜是一种成分较复杂的基质，有天然色素和姜辣素类物质，实验采用较为成熟的固相萃取技术净化，选用Carb-NH2石墨化碳小柱，来除去基质成分中的干扰。

图3 三种方法平均回收率对比Fig.3 Comparison of average recovery rates of the three methods

本实验对比了三种前处理方法，Quechers法和传统固相萃取[23]两种方法以及本次试验所采用的改良方法。Quechers法速度上更快操作简单，但是回收率低，净化效果不佳，干扰大；而传统固相萃净化较Quechers法更好，回收稳定，但前处理过程，所需样品量和提取试剂量都大，耗时长，振摇效果不如涡旋、离心效果好，改进后的方法比传统的方法提取效率更高，更节约时间。三种前处理方法平均回收率见图3。由图可知，三种方法中，改良固相萃取方法回收更高。因此本试验采取离心和过柱相结合的方式对生姜中的黄樟素进行提取。

2.4 基质效应

基质效应（Matrix effect，ME）是复杂基质中目标物的检测中必需考虑的问题。考察基质效应通常采用下列公式[24]计算：

式中：Sm表示基质标准曲线的斜率，Sn表示溶剂标准曲线的斜率。

当ME＞0时，表示基质对待测物有基质增强效应；ME＜0为基质抑制效应。|ME|≤20%，可认为该基质没有基质效应；若其值在20%～50%之间，则表明该基质有中等基质效应；若|ME|＞50%，则表明基质效应很强。本试验基于目标物（0.1 mg/kg）在基质匹配标准溶液的响应值（Sm）和在乙腈纯溶剂中的响应值（Sn），考察了黄樟素在生姜中的基质效应。结果为30.2%，为中等基质效应。为消除基质效应的影响，本试验采取基质标液校准匹配法。

2.5 标准曲线及检出限

基质标准工作溶液：吸取净化后的基质空白溶液配制成 0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL基质标准工作溶液（基质标准工作溶液现用现配）。将上述配制成的浓度系列基质标准工作溶液，按照2.2.2所述GC-MS/MS仪器优化条件上机检测，以待测化合物定量离子的强度y为纵坐标，浓度x（mg/L）为横坐标，作标准曲线得到黄樟素的线性方程及相关系数。结果表明黄樟素在0.005～0.5μg/mL质量分数范围内与对应的峰高呈良好线性关系（R2≥0.999），线性回归方程为Y=774943.0X-1053.366。在空白基质中添加标准溶液，上机检测，以 3倍信噪比（S/N≥3）计算该方法的检出限（LOD），以10倍信噪比（S/N≥10）计算该方法的定量下限（LOQ）。黄樟素残留的检出限（LODs）为 0.42 µg/kg，定量限（LOQs）为 1.41 µg/kg。

2.6 方法的回收率

表2 黄樟素在生姜中的平均回收率和相对标准偏差Table 2 The average Recovery and relative standard deviation of safrole in ginger

不含黄樟素的空白生姜样品中加入适量黄樟素标准溶液，加入5、25、50 µg/kg 3个浓度水平进行加标回收试验，按 1.4节进行前处理，每个水平测定6次，对其测定值做回收率和相对标准偏差（RSD）计算，其结果见表 2。结果表明：黄樟素的平均回收率为 107.8%～111.8%，相对标准偏差（RSD）为2.02%～2.38%。

图4 阳性样品总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of positive sample

图5 阴性样品总离子流色谱图Fig.5 Negative sample total ion chromatogram

2.7 实际样品检测

采用本方法对采集的生姜样品进行黄樟素含量测定。因生姜基质干扰较大，本次实验采用了三对离子碎片定量定性。图4为生姜阳性样品总离子流色谱图。图5为生姜阴性样品总离子流色谱图。结果表明：对151份生姜样品（包含仔姜、老姜和腐烂姜）进行黄樟素定性检测，其中23份生姜样品检出黄樟素，检出率为15.2%，最低检出量为0.45 µg/kg，最高检出量为1.3 µg/kg。即生姜样品中是天然存在微量黄樟素的，远低于欧盟标准。

3 结论

本实验建立了固相萃取净化结合气相色谱-质谱联用仪检测生姜中的黄樟素的分析方法。通过乙腈提取，高速离心机离心，过固相萃取小柱洗脱淋洗，旋转蒸发后定容检测。通过考察该方法的性能参数，结果表明其线性范围、检测限、平均添加回收率及其相对标准偏差等指标均满足生姜中黄樟素的快速、高效、准确定性与定量分析，为生姜及其生姜制品中的黄樟素筛查提供技术支持。经过对大量实际样品，包含仔姜和老姜的测试，发现生姜中黄樟素含量并不高，生姜中的黄樟素并不能引起质量安全风险。