NC-100大孔树脂对速溶茶农药残留的降解作用

裴少芬，邵增琅，王晓霞，唐杏燕，黄叶飞，黄鸣

（南京融点食品科技有限公司，江苏南京 211300）

速溶茶是将茶叶或茶鲜叶用水提取，然后经萃取、过滤、浓缩和干燥等工艺制成，具有冲饮携带方便，易与其它食品调配等特点[1]，它保留了传统茶叶中的营养成分和风味物质，具有茶对人体的一切功效。目前，速溶茶在国内外饮料及其他食品中作为原料或添加剂而被广泛应用[2]。

茶树性喜温暖湿润，种植密度又高，使得茶园中的茶树很容易滋生病虫害，喷施农药成为茶园除草抗虫害的最主要防治手段，农药的施用给农作物的丰产带来了保障，同时也给农产品本身和种植土壤带来污染，农药的滥用现象层出不穷，这必会引起农药的残留问题[3]。速溶茶中的农药残留主要来源于喷施农药、水、土壤、空气漂移和沉降等几个方面[4,5]，近年来，各茶叶进口国和地区纷纷制定了更严格、更广泛的标准，增加了茶叶检验农药的种类，降低了最高残留限量(MRL)的指标，严重影响我国茶叶产品的出口贸易[6,7]，因此，研究如何高效快速的降低速溶茶中农药残留问题显得尤为重要。

目前，常见的降解农副产品的农药残留方法有氧化降解、光催化化学降解、膜分离降解、超声波、微波降解和树脂吸附降解等[8,9]。其中氧化降解、光催化化学降解等化学方法用于农药残留去除可能会形成毒性比母体更强的降解产物，树脂吸附等物理吸附后不会有降解产物存在，且相比之下，大孔吸附树脂具有效率高、成本低、操作简单、再生处理方便等特点[10-12]。本文将速溶茶的半成品提取液或浓缩液通过大孔吸附树脂，研究了树脂对速溶茶粉中常见的微量农药的吸附效果以及对速溶茶中主要成分茶多酚的损失率影响，筛选出一种具有良好吸附率的NC-100树脂，并确定其最佳的加工工艺及参数，此研究将对丰富速溶茶深加工理论、提高速溶茶加工技术、促进我国速溶茶出口都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

NaCl、乙醇、NaOH、HCl（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；乙腈、甲酸（色谱纯），美国 Sigma-Aldrich公司；乙酸铵、甲醇（色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司；MgSO4、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化碳黑（GCB）：上海安谱实验科技股份有限公司；尼龙有机相微孔滤膜（0.22 μm）：德国 C&B公司；NC-100、D1300大孔吸附树脂，上海秀特化工科技有限公司。

噻嗪酮（buprofezin）、多菌灵（carbendazim）、茚虫威（indoxacarb）、异丙威（isoprocorb）、噻虫嗪（thiamethoxam）标准品：100 μg/mL，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 仪器与设备

AL204电子分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；1260-6420液质联用仪，美国Aglient公司；XW-80A涡旋混合仪，金坛希望科研仪器有限公司；RJ-TGL-1650台式高速离心机，无锡瑞江分析仪器有限公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；明澈 TM-D24UV超纯水系统，美国Merck Millipore公司；LLS PLUS实验蠕动泵，卡川尔流体科技有限公司；DC-0506低温恒温槽，上海比朗仪器制造有限公司；层析柱（内径-外径：25～32 mm，长度：600 mm），北京满仓科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 质谱条件

电喷雾离子源（ESI），正离子模式；扫描模式：多反应监测（MRM）；干燥气为氮气，流速和温度分别为10 L/min和350 ℃；毛细管电压为3500 V；雾化气压为40 psi，其它质谱参数见表1。

表1 5种农药的MRM参数Table 1 The MRM parameters of the 5 kinds of pesticides

表2 梯度洗脱程序Table 2 Program of the gradient elution

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.7 μm，3.0 mm×50 mm）；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流速0.3 mL/min。流动相：A为乙腈（含0.1%（V/V）甲酸），B为5 mmol/L的乙酸铵水溶液[含0.1%（V/V）甲酸]，流动相梯度洗脱程序见表2。

1.3.3 样品前处理

树脂吸附前后液测定：取10 mL茶水于50 mL离心管中，用10 mL乙腈提取，涡旋振荡5 min，加入NaCl 2.5 g，涡旋振荡2 min，并于10000 r/min离心5 min，收集上层有机相，移取1 mL上层乙腈提取液加入到装有150 mg MgSO4、50 mg PSA和50 mg GCB[13]的2 mL离心管中，涡旋振荡2 min，15000 r/min离心5 min，移取200 μL净化液至2 mL离心管中，加入800 μL超纯水，涡旋振荡1 min后过微孔滤膜备用[14]。

树脂活化：

用蒸馏水反复清洗→用95%乙醇浸泡24 h，使树脂充分溶胀→用4%～5%的HCl浸泡6 h，用蒸馏水洗至中性→用4%～5%的NaOH浸泡6 h，用蒸馏水洗至中性备用[15]。

1.3.4 吸附实验

1.3.4.1 静态吸附试验设计

分别准确称取一定量的经处理的 NC-100、D1300大孔树脂于100 mL具塞磨口的三角瓶中，加入一定量的速溶茶溶解液，120 r/min摇床振荡24 h，摇床温度设为与溶解液相同温度，以速溶茶溶解液中五种农药的吸附率和主要成分茶多酚的损失率来考察树脂的吸附效果。

树脂吸附率E和吸附量Q的公式如下：

式中：Q：饱和吸附量，mg/g；E：吸附率，%；C0：吸附前浓度，mg/mL；C1：吸附后浓度，mg/mL；V：溶液体积，mL；W：树脂重量，g。

茶多酚总量的测定：按照GB 8313-87用酒石酸亚铁进行比色分析[16]。

1.3.4.2 动态吸附试验设计

准确称量经处理的NC-100树脂60 mL装入层析柱中（内径-外径：25～32 mm，长度：600 mm），然后将层析柱固定放于低温恒温槽中以保持溶解液适宜的温度，最后通过蠕动泵控制将速溶茶溶解液以一定流速通过树脂层析柱进行吸附，以速溶茶溶解液中五种农药的吸附率和主要成分茶多酚的损失率来考察树脂的吸附效果。

在静态吸附实验的基础上分别设计动态试验的单因素水平，单因素包括：溶解液的流速、温度、pH以及浓度，在单因素试验基础上，采用正交试验优化农药残留吸附工艺条件[17]，正交试验设计见表3（其中速溶茶溶解液的处理量用BV表示，BV=流过吸附柱的溶解液体积/树脂的床层体积）。

表3 L9(34)正交实验因素水平表Table 3 L9(34)Orthogonal experimental factors level table

1.3.5 数据处理

采用Excel 2003对实验数据进行整理，Origin 8.5软件作图，采用SPSS 17.0进行差异性分析，显著性水平设置为p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

图1 标准品多反应监测离子色谱图Fig.1 Multiple reaction monitoring (MRM) chromatograms of mixed standards solution

本实验以poroshell 120EC-C18作为分析柱，对比了甲醇和乙腈作为有机相时的分离效果，试验结果发现用乙腈作为有机相时各目标化合物的分离效果最好，因此选用乙腈作为有机相，而在水相中加入0.1%的甲酸时，为系统提供质子化的H+离子，使各化合物在ESI+离子模式下的电离效果更好，再加入5 mmol/L的乙酸铵，更有助于离子化，目标化合物的峰型和灵敏度都得到了明显的改善，因此本实验选取乙腈及5 mmol/L的乙酸铵水溶液（含0.1%（V/V）甲酸）作为流动相，经梯度洗脱所得的多反应监测离子流色谱图见图1。

2.2 方法学评价

为了消除基质效应对测定结果的影响，本方法采用基质标准曲线对速溶茶粉中5种农药进行分析[18,19]，按照优化后的色谱质谱条件对这5种农药做基质标准曲线（见表4），结果表明这5种农药在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数 r2≥0.995，采用向空白样品中逐级降低加标浓度的方法来确定定量限(LOQ)，以信噪比为10的目标物浓度作为定量限，本方法的定量限均小于国标或欧盟法令中对茶叶及相关制品中这5种农药最大残留限量的要求[20-24]，表明本方法适用并满足速溶茶粉中这5种农药残留检测的要求。

在1 LOQ和4 LOQ两个浓度添加水平下进行5种农药的回收率和精密度实验，试验重复3次，按照1.3.3所述进行前处理后上机测试，结果见表5，在 2个浓度添加水平下的各组分平均回收率均在76.4%～114.5%，RSD均在2.3%～4.8%，符合美国分析化学家协会（AOAC）对农产品中农药残留检测分析的要求[25]，说明该方法具有良好的准确性和精密度。

表4 5种农药测定的线性方程、相关系数、定量限和MRL值Table 4 The linear equations, R2, limits of quantitation (LOQ) and MRL obtained for 5 pesticides

表5 5种农药的回收率和精密度Table 5 The recoveries and RSDs of 5 pesticides spiked at low and high concentrations

表6 大孔树脂参数Table 6 The parameters of macroporous resins

表7 不同树脂类型对速溶茶溶解液中5种农药和茶多酚的吸附影响Table 7 Effects of different resin types on the adsorption of 5 pesticides and tea polyphenols in instant tea solubles

2.3 树脂静态吸附试验

通过试验考察了两种大孔树脂类型对速溶茶溶解液静态吸附的影响，测定了吸附前后溶解液5种农药的残留变化，以及吸附过程对速溶茶粉的主要成分茶多酚的损失率影响，所选的两种大孔树脂具体参数见表6，试验结果见表7。

对照表6和表7可以看出，这两种树脂类型对五种农药和茶多酚的吸附存在差异，这可能是与树脂的极性、比表面积、孔径大小等物理性质都有关系，这两种大孔树脂对五种农药的吸附能力具有较大差别，并且对速溶茶中主要成分茶多酚也有一定的吸附作用，但茶多酚的吸附率远低于这5种农药的吸附率，非极性、孔径粒径较小的NC-100树脂对5种农药的吸附率均在70%以上，而茶多酚的吸附率仅为19.1%，非极性、孔径粒径较小的NC-100树脂对5种农药的吸附率都高于D1300型，但两种树脂类型对茶多酚的损失率影响较小，由此可以得出本实验对五种农药的最佳吸附树脂需要有弱的极性和较小的孔径粒径，综合考虑，NC-100型树脂具有良好的吸附特性，因此本实验选取 NC-100型树脂来研究对速溶茶溶解液中的农药和茶多酚的吸附效果。

2.4 树脂动态吸附试验

2.4.1 流速对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响

图2 流速对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响Fig.2 Effect of flow rate on removal rate of pesticides and loss rate of tea polyphenols

通过对速溶茶溶解液设置不同流速（3、4.5、6 BV/h）来考察NC-100对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响，本实验中流速的选择取决于物料的粘稠度、固形物的含量等，由蠕动泵控制，当低于3 BV/h时，实际操作不易控制且速溶茶溶解液流经整个层析柱的时间延长，试验耗时较长，试验初期通过预实验确定3 BV/h为最低流速限值，试验结果见图2所示。

从图2可以看出，随着流速的增加，大孔树脂对速溶茶溶解液中 5种农药残留的吸附随之下降，去除率逐渐降低，异丙威的下降幅度最大，达到了20%，其余四种农药残留的下降幅度则也都超过15%，原因可能是由于流速越慢，农药残留在树脂表面的停留时间相对会较长，更有利于进行充分扩散，从而提高树脂的吸附性能，流速越快，会使得固液接触时间较短，从而降低吸附柱的效果，同时，流速升高的同时也使得速溶茶的有效成分茶多酚的损失率增加，从图 2可以看出，随着流速增加，速溶茶有效成分茶多酚的损失率提高了 9%，这与王卿[26]等用大孔树脂吸附降解速溶茶中的吡虫啉和啶虫脒的研究结果基本一致，但该论文显示流速对速溶茶中主要成分茶多酚的损失率影响较小，这可能是由于不同的树脂类型表面结构不同、速溶茶中农药残留的种类、含量和物理化学性质都有所差异引起的，因此实验选取3.0 BV/h为较好的流速。

2.4.2 上柱液 pH对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响

设置不同pH值(3、5和7)的速溶茶溶解液来考察大孔树脂NC-100对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响，试验结果如图3所示。

图3 溶解液pH值对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响Fig.3 Effect of pH on removal rate of pesticides and loss rate of tea polyphenols

考虑到茶多酚在酸性介质中较稳定，在碱性介质中极不稳定，因此本实验将pH的考察范围设置为3～7，从图3可以看出：树脂在pH=5时对各农药残留有较好的吸附效果，原因可能是此pH值是NC-100树脂较适宜吸附的 pH值，而多菌灵随着pH值的增加去除率不断降低，从68%降至59%，原因可能是由其物理化学性质决定的，多菌灵在碱性溶液中缓慢分解，随着pH升高，分解加快，这与张全兴等[27]用树脂吸附处理多菌灵农药及中间体废水的研究结论一致，多菌灵在水中呈弱碱性，微溶，能被树脂大量吸附，但在酸性介质中易溶，吸附减弱。而其余四种农药在pH=5时都具有最高的去除率，但是溶解液中有效成分茶多酚的吸附率并无明显差别，随着pH的上升，茶多酚的损失率仅下降了2.0%，综上，选取pH为5时，速溶茶溶解液有较好的吸附。

2.4.3 温度对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响

设置不同温度(60 ℃、70 ℃和80 ℃)的速溶茶溶解液来考察大孔树脂NC-100对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响，试验结果如图4所示。

图4 溶解液温度对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响Fig.4 Effect of temperature on removal rate of pesticides and loss rate of tea polyphenols

从图4可以看出，随着温度的升高，树脂对速溶茶溶解液中5种农药残留和茶多酚的吸附率不断提高，原因可能是NC-100型树脂对这5种农药的吸附为吸热反应，高温有利于吸附，5种农药残留的去除率都提高了约10%，虽然茶多酚的损失率随着温度的升高增加了 5%，但是从实际生产效果来看，提取温度的升高无疑可以增加茶多酚的溶解度，故提高温度对茶多酚的提取是有利的，但过高的温度会促进茶多酚的氧化，也增加能耗，所以本实验设置的最高温度值为80 ℃，这与张斌等[15]用大孔树脂吸附分离速溶茶副产品中茶多酚的研究结论一致，树脂吸附茶多酚存在最佳的温度范围，当低于此温度值时，溶质分子扩散速度加快，粘度下降有利于吸附，但高于此温度值时，吸附量则呈下降趋势，且茶汤在低温环境下，粘度增大，茶多酚易与结合蛋白等形成茶乳酪[28]，从而造成物质的分子量和极性的改变，对后续速溶茶加工工序中的陶瓷膜过滤等带来不便，因此，综合考虑选取 80 ℃为速溶茶溶解液最佳的吸附温度。

2.4.4 溶解液浓度对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响

设置不同浓度(50、75和100 mg/mL)的速溶茶溶解液来考察大孔树脂NC-100对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响，速溶茶溶解液的配制过程中，茶粉与水的添加比例设置为1:10～1:20，当浓度高于100 mg/mL时，样品较粘稠，不易前处理，且5种农药残留的相对浓度也会升高，机子的残留也会增加，清洗时间则需要延长，所以从样品的前处理和保护仪器的角度考量，选取100 mg/mL作为溶解液的最高考察浓度。试验结果如图5所示。

图5 溶解液浓度对农药残留去除率和茶多酚损失率的影响Fig.5 Effect of concentration on removal rate of pesticides and loss rate of tea polyphenols

从图5可以看出，随着速溶茶溶解液浓度的增加，NC-100型树脂对速溶茶中农药残留和茶多酚的吸附也逐渐提高，速溶茶溶解液在100 mg/mL时，NC-100对5种农药残留的去除率最高，吸附率均已超过70%，对速溶茶中主要成分茶多酚的吸附量也最大，说明在该浓度下，树脂的吸附容量还未达到饱和状态，这可能是由于大孔树脂对速溶茶溶解液的吸附平衡引起的。溶解液浓度从 50升至 100 mg/mL时，树脂对茶多酚的吸附率增加了约4%，这与张斌等[29]用大孔树脂吸附分离茶多酚、咖啡碱的研究结论相反，该论文描述上样液浓度升高，茶多酚吸附率逐渐下降，浓度偏高，则泄漏点早，处理量小，树脂使用周期短，但考虑到树脂吸附量浓度大小主要受速溶茶溶解时茶粉与水的浸提比影响，浓度过小必定会使加工提取时用水量增大，不利于后续加工工序中的浓缩和干燥步骤，因此本试验确定速溶茶溶解液在 100 mg/mL时为较好的吸附浓度。

2.4.5 动态吸附正交试验结果根据动态单因素吸附试验，分别以速溶茶溶解液的流速、pH、温度和浓度为实验因素进行L9(34)正交试验，试验重复2次，结果如表8～11所示。

表8 农药残留去除率正交试验分析Table 8 Orthogonal experimental analysis of pesticide residue removal rate

表9 四因子不同水平对农药残留去除率的影响Table 9 Effects of different levels of four factors on the removal rate of agricultural residues

表10 茶多酚损失率正交试验分析Table 10 Orthogonal experimental analysis of tea polyphenols loss rate

8 3 2 1 3 19.2 17.5 9 3 3 2 1 17.5 15.2 K1 102.3 94.3 94.5 95.0 - -K2 83.2 97.4 93.1 88.5 - -K3 101.8 95.6 99.7 103.8 - -k1 17.1 15.7 15.8 15.8 - -k2 13.9 16.2 15.5 14.8 - -k3 17.0 15.9 16.6 17.3 - -R 3.2 0.5 1.1 2.5 - -最佳组合 A1B2C3D3

表11 四因子不同水平对茶多酚损失率的影响Table 11 Effects of different levels of four factors on the loss rate of tea polyphenols

由表 8的极差分析结果可知，RD＞RC＞RA＞RB，即在本次的动态吸附试验中，对农药残留去除率影响最大的是溶解液的浓度，其次是温度和流速，最后是 pH。由表 10的极差分析结果可知，RA＞RD＞RC＞RB，即在本次的动态吸附试验中，对茶多酚损失率影响最大的是溶解液流速、其次是浓度、温度和pH；该试验确定的最佳组合都为A1B2C3D3，由表9的方差分析结果表明，除溶解液的pH对农药残留去除率无显著影响外，其余各因素对农药残留去除率均有极其显著的影响，由表 11的方差分析结果可知，溶解液流速对茶多酚损失率有极显著影响，浓度则对其影响显著，而pH和温度对茶多酚损失率并无显著影响，综合考虑，选取 A1B2C3D3为最佳的吸附条件，即上样流速3.0 BV/h、pH为5、温度为80 ℃和浓度为100 mg/mL。

2.4.6 动态吸附验证试验

表12 动态吸附验证试验Table 12 Dynamic adsorption verification test

将动态吸附正交试验所得到的最佳组合：流速3.0 BV/h，pH为5，温度为80 ℃和浓度为100 mg/mL，进行验证性试验。重复3次实验，取其平均值，结果如表12所示，在该工艺条件下5种农药残留去除率可达75.1%～90.4%，而茶多酚损失率为17.6%，对比正交实验结果可知，该组合为速溶茶溶解液动态吸附的最佳条件。

3 结论

本文建立了高效液相色谱串联质谱法测定速溶茶溶解液中5种农药残留的方法，该方法定量限为0.01 mg/kg，良好的线性关系、回收率和精密度等指标表明此方法满足对速溶茶溶解液中农药残留的精准定量检测要求。通过静态吸附试验比较了两种树脂对速溶茶溶解液中农药残留和茶多酚的吸附特性，从中筛选出NC-100树脂具有较好吸附效果，随后进行该树脂的动态吸附试验，设计速溶茶溶解液流速、pH、温度和浓度4个因素的单因素试验，通过正交统计法获得最佳吸附条件：流速3.0 BV/h，pH为5，温度为80 ℃和浓度为100 mg/mL，此研究将对丰富速溶茶深加工理论、提高速溶茶农药残留降解技术、促进我国速溶茶出口都具有重要意义。