气相色谱-串联质谱同位素内标法测定果蔬食品中有机锡类农药残留

梁艺馨，李洁，刘康书，蔡秋，朱明，戴唯，王缅，王兴宁

（贵阳海关综合技术中心，贵州贵阳 550081）

有机锡化合物用途十分广泛，常用作聚乙烯薄膜的稳定剂、室温硫化过程的催化剂和船底的防污剂等[1]。有机锡类化合物因其高效、持效期长的特点作为杀菌和杀螨农药也广泛用于农业领域，目前有机锡类农药主要有三唑锡、三环锡、薯瘟锡（三苯基乙酸锡）、毒菌锡（三苯基氢氧化锡）和苯丁锡等，例如三唑锡可用以柑桔的杀螨剂，防治全爪螨等，薯瘟锡可用于防治马铃薯的晚疫病，提升产量，苯丁锡用于防治山楂、桃、苹果等水果蔬菜种植过程中的各种植食性螨类害虫。同时，有机锡类化农药也会对生物体造成损害，属剧烈神经毒物，会导致中枢系统脑白质水肿，使细胞能量利用中氧化磷酸过程受障，对胸腺和淋巴系统进行影响，甚至还会引起糖尿病和高血脂等疾病[2]。若经由呼吸道、消化道和皮肤黏膜进入人体内，还会诱导细胞死亡，减弱机体对抗肿瘤和抗病毒感染[3]。鉴于有机锡类农药对人体和环境造成的不良影响，国内外相关部门已对其残留量做出限制甚至禁用，我国食品安全国家标准GB 2763-2019中对水果和蔬菜中有机锡类化合物残留量有明确规定，其中三唑锡限量范围为0.1～2 mg/kg，三环锡0.1～0.3 mg/kg，薯瘟锡（三苯基乙酸锡）0.1～5 mg/kg，毒菌锡（三苯基氢氧化锡）0.1 mg/kg，苯丁锡0.5～10 mg/kg。国际方面，以日本为例，食品中残留农业化学品肯定列表规定，三苯锡在食物中的最大残留限量为 0.02～0.2 mg/kg，苯丁锡限量0.05～20 mg/kg；欧盟农残限量标准规定，薯瘟锡和毒菌锡最大残留量为0.1 mg/kg。

目前国内外有关食品中有机锡类化合物的分析方法较多，常用的检测方法主要有液相色谱法[4-6]、气相色谱法[7-10]、液相色谱-质谱法[11-14]及气相色谱-质谱法[15-17]等。相较于液相色谱法和气相色谱法，液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法具有更高的灵敏度和稳定性，目前也是较为广泛使用的检测方法，但测定有机锡类化合物时，能与液相色谱联用的灵敏检测器相对较少，不能有效克服因雾化引起的稀释效应从而使信号下降，而气相色-谱质谱法具有很好的灵敏度，且能分析多种有机锡形态，选择性较好。与气相色谱-单四极杆质谱法（GC-MS）相比，对于基质相对复杂的食品，气相色谱-三重四极杆质谱法具有更好的抗干扰性。目前有很多研究均采用外标法检测有机锡类化合物，但尚未见到使用内标法测定食品中有机锡类农药残留的文章，由于内标物与被测组分的峰面积比值不受进样量波动的影响，使用同位素内标法测定能在一定程度上消除了前处理方法所引起的误差及基质效应，因此结果更为准确。本文以四乙基硼化钠作为衍生试剂，采用气相色谱-串联质谱同位素内标法测定果蔬食品中三环锡、薯瘟锡、苯丁锡等有机锡类农药的残留。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

7890B/7000C气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；Allegra X-30R高速离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；Turbo Vap LV氮吹仪，美国Biotage公司；230Volt振荡器，美国Talboys公司；Milli-Q去离子发生器，美国Millipore公司；PB1502-L电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

标准品：三环锡（纯度98%）、薯瘟锡（纯度98%），购自德国 Dr.Ehrenstorfer公司，苯丁锡标准品（100 μg/mL，纯度≥97%），购自坛墨质检标准物质中心，三苯基锡-d15（纯度 98.1%），购自加拿大 C/D/N Isotopes公司。

正己烷、丙酮（色谱纯），德国CNW公司；乙腈（色谱纯），德国默克公司；四乙基硼化钠（NaBEt4，纯度98%），美国Stem chemicals公司；甲醇（色谱纯），德国默克公司；冰醋酸（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；PC/NH2-SPE固相萃取柱（1000 mg/6 mL），天津博纳艾杰尔科技有限公司；无水硫酸钠（农残级），北京百灵威科技有限公司；氯化钠（农残级），成都西亚化工股份有限公司。

雪桃、油桃、柑桔、茄子、洋葱等样品购于市面。

1.2 标准溶液配制

标准储备液：分别称取三环锡、薯瘟锡有机锡类标准品各0.1000 g，用丙酮溶解并定容至100 mL容量瓶，即配制成1000 mg/L标准储备液，置于4 ℃冰箱保存备用；量取1.0 mL苯丁锡标准储备液，用丙酮稀释并定容至10 mL容量瓶中，置于4 ℃冰箱保存备用。

三苯基锡-d15标准储备液：称取0.1000 g三苯基锡-d15于100 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，置于4 ℃冰箱保存备用。

三苯基锡-d15标准工作液：取1.0 mL三苯基锡-d15标准储备液，用丙酮稀释成1.0 mg/L备用。

基质混合-三苯基锡-d15标准校正溶液：用丙酮稀释混合标准溶液和三苯基锡-d15标准工作液，加入到1.0 mL样品空白基质提取液中，使系列标准校正液浓度分别为 50、100、200、500、1000 μg/L（含三苯基锡-d15500 μg/L）。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

称取5 g（精确到0.01 g）试样于50 mL离心管中，加入500 μL浓度为1.0 mg/L三苯基锡-d15内标溶液，加入15 mL冰醋酸-乙腈（1:99，V/V），均质提取2 min，加入5 g氯化钠，振荡30 min，5000 r/min离心5 min，取上清液于试管中，再加入15 mL冰醋酸-乙腈（1:99，V/V），重复上述操作，合并提取液，于35 ℃水浴中减压浓缩至近干。加入1 mL甲醇溶解残留物，氮气吹至1 mL，转移至15 mL试管中待衍生。

1.3.2 衍生

向上述提取液中加入 5 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.5）及1 mL四乙基硼化钠溶液（2 g/100 mL），手动摇匀后旋涡器振振荡衍生反应25 min，加入2 mL正己烷提取衍生产物，混匀，5000 r/min离心5 min后取上清液，待净化。

1.3.3 净化

先用6 mL正己烷预淋洗PC/NH2-SPE固相萃取柱（柱内填好约1.5 cm无水硫酸钠），待溶液面降至无水硫酸钠层时，将上述衍生的提取液转移至PC/NH2-SPE柱，再用15 mL正己烷-丙酮（99:1，V/V）溶液洗脱，收集全部流出液，35 ℃下氮吹至近干，用正己烷溶解并经0.45 μm有机滤膜过滤定容至1 mL，进行气相色谱-串联质谱测定。

1.3.4 标准校正液的衍生

分别取不同浓度相同体积的混合-三苯基锡-d15标准校正溶液于15 mL离心管中，加入5 mL乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.5）及1 mL四乙基硼化钠溶液（2 g/100 mL），手动摇匀后振荡衍生反应25 min，然后加入2 mL正己烷提取衍生产物，混匀，5000 r/min离心5 min后取上清液，进行气相色谱-串联质谱测定。

1.4 气相色谱-串联质谱条件

1.4.1 气相色谱条件

色谱柱：DB-5色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：260 ℃，不分流进样；载气：氦气（纯度≥99.999%）；进样量：1.0 μL；程序升温：初始温度为 80 ℃，保持 1 min，以 20 ℃/min的速率升温至200 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min的速率升温至280 ℃，保持10 min。

1.4.2 串联质谱条件

电子轰击电离源（EI源）：传输线温度：280 ℃；离子源温度：230 ℃；碰撞气体：氩气；采用 MRM模式，每个化合物检测两对母离子-子离子。

1.5 数据处理

采 用 MassHunter GC/MS Acquisition B.070.01.1805软件进行数据采集，采用 MassHunter Workstation Software B.07.00软件进行数据分析和处理，图表采用Microsoft Excel 2010软件进行绘制。

2 结果与讨论

2.1 衍生化试剂的选择

有机锡类农药极性较大、不易挥发，难以直接使用气相色谱分析，因此需要先将其衍生为易气化的全有机取代的化合物再进行测定。常用的衍生方法主要有三种，一种是在酸性条件下利用硼氢化钠或硼氢化钾进行氢化反应[18]，缺点是衍生产物不稳定且容易挥发；第二种是采用格氏试剂在无水有机溶中进行[19,20]，但该方法会产生有害气体且需要分解多余的衍生试剂，操作较为繁琐；第三种则是在水溶液中加入四乙基硼酸钠直接进行乙基化衍生[21,22]，该方法无需分解过量的衍生试剂，反应过程也相对简单，形成的衍生物性质也稳定。本文分别使用了乙基溴化镁和四乙基硼酸钠作为衍生化试剂进行比较，按1.4条件对5种相同浓度的有机锡进行衍生，在相同条件下考察它们对衍生物峰面积的响应，结果见图 1。结果表明使用四乙基硼酸钠作为衍生剂时衍生物的峰面积更大，响应积极，因此本实验选用四乙基硼酸钠作为衍生剂，该条件下三唑锡会先水解成三环锡，三环锡的衍生物为三环己基乙基锡，内标物三苯基锡-d15与毒菌锡、薯瘟锡主要官能团相同，水解成三苯锡，三苯锡的衍生物为三苯基乙基锡[23]，苯丁锡的衍生物为三（2-甲基-2-苯基丙基）乙基锡。

图1 两种不同衍生剂对衍生物响应的峰面积Fig.1 Peak areas of different derivatization reagents on the derivatization products

2.2 四乙基硼化钠配制溶液的优化

四乙基硼化钠成本较高，化学性质不稳定，易水解，一般用甲醇或水配制，因此有必要使用合适的配制方法。卢大胜[24]等研究表明 2%四乙基硼化钠四氢呋喃溶液在半个月内不会出现降解和活性降低的情况，因此该配制方法得以广泛使用，朱萌萌[25]等研究对比发现，三环锡、三唑锡和苯丁锡经 2%四乙基硼化钠水溶液衍生后的应比经 2%四乙基硼化钠四氢呋喃溶液衍生的更高。由于三环锡和三唑锡的衍生物均为三环己基乙基锡，本实验在此基础上加入了三苯基锡的对比情况，结果如图2。结果表明，经2%四乙基硼化钠水溶液衍生的6种有机锡类化合物的响应值全面高于经 2%四乙基硼化钠四氢呋喃溶液衍生的衍生物，有利于提高本次分析检测的灵敏度。因此本实验选用2%四乙基硼化钠水溶液作为衍生剂，现配现用。

图2 四乙基硼化钠溶剂对衍生化效率的影响Fig.2 Effect of NaBEt4solvents on derivatization efficiency of organo-tin compounds

2.3 衍生时间的选择

图3 有机锡化合物衍生时间对衍生效率的影响Fig.3 Effect of derivatization time on derivatization efficiency of organo-tin compounds

反应时间太长会使有机锡分解，时间太短则会导致反应不够完全。按照1.4条件对同一浓度的3种有机锡化合物使用四乙基硼酸钠作为衍生剂进行衍生，研究不同衍生时间下它们峰面积的响应情况，结果如图3。结果表明衍生时间为 25 min时，除了苯丁锡不明显外，其余2种有机锡衍生物的峰面积最大，衍生效果最好，因此本实验选择衍生时间为25 min。

2.4 固相萃取柱的选择

目前大多数食品中有机锡类化合物的检测方法中，选择Florisil柱对试样进行净化，考虑到果蔬食品基质中干扰物大多是烷基酚类小分子干扰物、脂肪酸和色素等大分子干扰物，结合PC/NH2-SPE柱净化效果，特别是对于蔬菜水果等色素较高的样品的前处理有良好净化效果的特性，与Florisil柱净化效果进行对比。向雪桃试样中加入1 mg/kg混合标准溶液，提取并经四乙基硼化钠溶液衍生后，分别使用PC/NH2-SPE固相萃取柱和Florisil固相萃取柱进行净化，研究两种不同固相萃取柱对三种衍生产物的峰面积响应情况，结果如图4。

图4 不同固相萃取柱对净化效果的影响Fig.4 Effect of cleanupfororgano-tin compounds between PC/NH2-SPE and Florisil

结果表明，相同条件下，试样经PC/NH2-SPE柱净化，三环己基乙基锡、三苯基乙基锡和三(2-甲基-2-苯基丙基)乙基锡的峰面积响应均大于经 Florisil净化的结果，因此本次试验采用PC/NH2-SPE柱进行净化。

表1 内标法和外标法差异比较Table 1 Comparison of external standard method and internal standard method

2.5 内标法定量和外标法定量差异比较

准确称取5 g（精确到0.01 g）雪桃试样于50 mL离心管中，分别加入500 μL浓度为1.0 mg/L的混合标准溶液和三苯基锡-d15标准工作液，另取5 g（精确到0.01 g）试样于50 mL离心管中，只加入500 μL浓度为1.0 mg/L的混合标准溶液。两组试样均按照1.3提取、衍生和净化后上机测定，结果见表1。

从表1可以看出，相较于外标法，内标法测定试样的回收率更好。使用加入三苯基锡-d15内标溶液，能够反应出有机锡类化合物在前处理过程中的损失，因此本实验采用内标法测定。

2.6 质谱特征离子对的选择

图5 雪桃加标MRM模式色谱图Fig.5 MRM Chromatograms of three derivatization products

3种有机锡衍生物用电离源进行 Q1全扫描（50～580m/z），得到全扫质谱图，选择丰度较高，质荷比合适的碎片离子作为母离子，进行二级质谱扫描，从二级质谱图中选择响应较高的碎片离子作为子离子，最后改变碰撞电压来进行碰撞能量优化。3种有机锡衍生物的专利质谱条件见表2。

在选定的仪器条件下，3种有机锡化合物的衍生物可以得到良好的分离效果，见图5。

2.7 方法的线性范围、检出限和定量限

取50、100、200、500、1000 μg/L 5个质量浓度的混合-三苯基锡-d15标准校正溶液，按2.5中条件设定进样1 μL，以标准校正液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果见表3。以S/N=3确定检出限，以S/N=10确定定量限，结果见表3。结果显示3种有机锡衍生物的线性相关系数均大于0.998，三环锡、三苯基锡和苯丁锡衍生物的响应在50～1000 μg/L质量浓度范围内呈良好线性关系，检出限分别为0.03×10-1、0.03×10-1和 0.12×10-1mg/kg，均能满足国内外标准限量要求。

表2 3种有机锡衍生物的保留时间、监测离子对和碰撞能量Table 2 Retention time, monitoring ion pairs and collision energy of three derivatization products

表3 3种有机锡衍生物的线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficient, limit of determination (LOD) and limit of quantitation (LOQ) for three derivatization products

2.8 精密度和加标回收率

向雪桃样品中添加0.04、0.10、0.20 mg/kg的混合-三苯基锡-d15标准校正溶液，每个水平设置6个平行。将加标样品进行前处理，经提取、衍生后净化进行测定，计算加标回收率和精密度，结果见表 4。结果表明，本方法回收率范围为81.64%～106.23%，相对标准偏差为1.10%～6.30%。

表4 3种有机锡衍生物的添加回收率和精密度Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of three derivatization products (n=6)

2.9 实际样品检测

取市售水果蔬菜共6个品种，按照1.3中方法处理并进行气相色谱-串联质谱分析测定，结果见表5，均未检出有机锡化合物。

表5样品检测结果Table 5 Sample test results

3 结论

本文采用四乙基硼化钠衍生，气相色谱-串联质谱同位素内标法测定桃中有机锡类农药残留。该方法回收率范围为 81.64%～106.23%，相对标准偏差为1.16%～6.33%（n=6），三环锡、三苯基锡和苯丁锡的方法定量限分别为 0.10×10-1、0.09×10-1、0.39×10-1mg/kg，符合分析方法的要求，操作简单高效，具有灵敏度高、稳定性好的特点，且与外标法测定有机锡类农药残留的方法相比，同位素内标法定量能在一定程度上消除基质效应，使测定结果更为准确，可用于水果蔬菜等农产品中有机锡类农药残留的检测，并为其他食品中有机锡类农药残留的检测提供依据。