亚硒酸钠和硒代蛋氨酸对人结肠腺癌细胞的毒性作用

覃焱，许海钊，徐境懋，顾明华，韦燕燕

（广西大学农学院，广西农业环境与农产品质量安全重点实验室，广西南宁 530004）

硒（Se，selenium）是一种人体必需的微量元素，是生物体内多种重要酶重要组成部分，具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力等作用[1]，据统计，全世界有40多个国家和地区缺硒，中国是世界上缺硒最严重的地区，三分之二的地区属于缺硒地区，约站国土面积70%，其中30%为严重缺硒地区（硒含量小于或等于0.02 mg/kg），全国有72%的人口存在不同程度的硒摄入不足[2,3]，缺硒会导致大骨节病、克山病的发生，在大骨节病区人群补充硒可稳定控制病情[4]。由于人体内不能合成硒，只能靠外界摄入来补充。硒的形态可分为无机硒和有机硒，其中亚硒酸钠是常见的无机硒营养补充剂，而硒代蛋氨酸是植物中硒的主要形式，也是重要的有机硒营养补充剂。但是，硒对动物既有营养性又存在毒性，且其营养剂量和毒性剂量范围较窄，摄入过量的硒会引起中毒，如急性毒性，慢性毒性，免疫毒性以及细胞毒性等[5]，胡滨[6]等利用小鼠模型进行亚硒酸钠的急性和蓄积毒性试验研究，结果表明小鼠在5.61 mg/kg、7.90 mg/kg亚硒酸钠溶液灌胃4 min后开始出现活动减少、嗜睡、乏力，反应迟钝等状况。随后精神极度沉郁，站立不稳，呼吸困难，全身抽搐后死亡。而近期的研究则表明，硒毒性依赖于其化学形式，无机硒化合物毒性强于有机硒化合物[7,8]。因此，进一步阐明无机硒与有机硒的生物学效应和毒性差异，为缺硒人群选择合适硒源、合理补充硒提供科学依据。

肠道是人体中重要的消化器官，单层肠上皮细胞在机体和外部环境之间形成了一道物理和功能性的屏障，调节维持人体生命活动所需营养物质的吸收、转运，并能够抵御有害物质侵袭发挥重要作用。Caco-2细胞来自人结肠癌细胞，其结构和生化作用类似于人体小肠上皮细胞，目前是用于研究肠上皮细胞的常见体外模型[9]。目前，不同硒形态对对肠道上皮细胞Caco-2细胞的生物效应机制研究不多。本研究采用体外培养的 Caco-2细胞，探讨两种不同形态硒化合物（亚硒酸钠和硒代蛋氨酸）对肠细胞的毒性和氧化应激作用，为进一步阐明硒的细胞毒性作用机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

MCO-18AIC二氧化碳培养箱，日本三洋电机株式会社；SW-CJ-1F型超净工作台，中国苏净安泰公司；80-2电动离心机、XDS-1B型倒置显微镜均购自重庆光电仪器有限公司；M200型酶标仪，瑞士Tecan公司；亚硒酸钠（Na2SeO3，SeIV，分析纯）、硒代蛋氨酸（C5H11NO2Se，SeMet，纯度99.5%）、MTT试剂、Annexin V-FITC/PI双染色法试剂盒、SOD酶检测试剂盒、LDH酶检测试剂盒、GSH检测试剂盒、BCA蛋白试剂盒、DMEM高糖完全培养基、25% EDTA胰酶，PBS购买于索来宝公司；胎牛血清购买于四季青；人结肠腺癌Caco-2细胞购于中国科学院干细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

细胞传代于25 cm2的培养瓶中，用10%的胎牛血清，1%的双抗高糖完全培养基，并置于37 ℃，5% CO2的培养箱中进行培养。当细胞长到80%左右，用PBS清洗细胞，25% EDTA胰酶消化细胞，以每孔106个接种于6孔板，每孔105个接种于12孔板，6孔板培养48 h后更换含硒培养基，每孔1 mL，培养24 h后用于检测细胞凋亡。12孔板每隔2 d换一次新鲜培养基，培养7 d后，更换含硒化物的培养基，每孔1 mL，用于检测酶。

1.2.2 硒溶液配制

准确称量适量的SeIV，SeMet溶于PBS中，过滤除菌后，用含10%胎牛血清的培养基稀释成适当的硒剂浓度。其中SeIV 为0.4、0.8、2.0、4.0、8.0 μg Se/mL，SeMet为 0.8、40、80、160、320 μg Se/mL。

1.2.3 细胞凋亡检测

待细胞处于对数生长期，以每孔 105个细胞接种于6孔板，培养7 d后加入含0.8 μg Se/mL的SeIV和SeMet的培养基培养，并设置不含硒的空白组进行对照。细胞经处理24 h后，弃去培养基，用不含EDTA的 25%胰酶消化细胞并收集，用预冷的 PBS清洗三次，800 r/min离心5 min。再将收集好的细胞重悬于结合缓冲液中，调整细胞密度为5×108细胞/L。加入5µL AnnexinV-FITC和5 µL PI，混匀，室温避光孵育10 min染色。设置以下对照组：单独加细胞不染色、细胞单独染Anexin V-FITC和细胞单独染PI。200目筛网过滤后，用ACCURI C6型流式细胞仪流式细胞仪检测AnnexinV-FITC和PI的荧光强度（Ex=488 nm，Em=525 nm；Ex=488 nm，Em=620 nm），每个剂量设置3个平行孔。

1.2.4 细胞存活率的测定

待细胞处于对数生长期时，用胰酶消化以每孔7000个细胞接种于96孔板培养48 h，48 h后每孔加入100 μL含硒培养基，处理浓度分别为SeIV 0.4、0.8、2.0、4.0、8.0 μg Se/mL，SeMet为 40、80、160、320 μg Se/mL，并设置不含硒的培养基空白组作为对照。培养24 h后每孔加入10 μL MTT（5 g/L），温育4 h后弃去上清液，每孔加入200 μL DMSO，震荡10分钟，于酶标仪490 nm处检测吸光（A）值，代入以下公式：

应用线性回归模型计算各硒化物对细胞的半抑制浓度（IC50），实验重复3次，每个剂量（含对照）设置6个平行孔。

1.2.5 细胞染毒及酶的测定

待细胞处于对数生长期，以每孔 105个细胞接种于6孔板，培养7 d后加入含硒的培养基培养，处理浓度为 SeIV 0.8、4.0、8.0 μg Se/mL，SeMet为 40、80、160 μg Se/mL，并设置不含硒的空白组进行对照。细胞培养24 h收集培养上清液，冷冻PBS清洗细胞2次后，用定量PBS收集细胞，采用超声波破碎细胞。用相关试剂盒检测SOD、GSH、LDH、总蛋白，每个剂量设4个平行孔孔，具体操作方法严格按照试剂盒说明书进行，LDH释放率计算公式为：

1.3 统计学分析

应用SPSS 24.0软件进行统计学处理分析，p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果和讨论

2.1 SeIV和SeMet处理下Caco-2细胞的凋亡率

在此前的研究中，1 μM 的亚硒酸钠显著提高了HepG-2细胞的凋亡率，1 μM的硒代蛋氨酸处理则不显著[11]。在本实验中，当浓度为0.8 μg Se/mL时，SeIV处理组的 Caco-2细胞的凋亡率与对照组相比显著增加（p＜0.05），而SeMet处理的细胞凋亡率差异不显著，见表1、图1，其中对应的细胞状态Q1是细胞坏死状态，Q2、Q3是细胞凋亡状态，Q4是细胞存活状态。由此说明在较低浓度时，SeIV即可对Caco-2细胞表现出一定的细胞毒性，从而导致细胞凋亡，但是SeMet则没有显著影响。

图1 0.8 μg Se/mL SeIV和SeMet处理下Caco-2细胞的凋亡图Fig.1 The effect of the SeIV and SeMet on apoptosis of Caco-2 cell (0.8 μg Se/mL)

表1 SeIV和SeMet培养对Caco-2细胞的凋亡率影响Table 1 The effect of the SeIV and SeMet on apoptosis of Caco-2 cell (n±3, )

表1 SeIV和SeMet培养对Caco-2细胞的凋亡率影响Table 1 The effect of the SeIV and SeMet on apoptosis of Caco-2 cell (n±3, )

注：*表示与对照组的差异显著（p＜0.05）。

处理组 凋亡率/%对照组（0 μg Se/mL） 5.38±0.57 SeIV（0.8 μg Se/mL） 19.09±0.95*SeMet（0.8 μg Se/mL） 4.75±0.39

2.2 不同硒形态作用下Caco-2细胞的存活率

本研究采用MTT评估不同硒形态对Caco-2细胞增殖的影响。结果显示，当 SeIV浓度范围是 0.4～8 μg Se/mL，细胞存活率分别为75.94%，74.10%，36.82%和 19.29%，均显著低于对照组（p＜0.05）；SeMet浓度范围是 40～320 μg Se/mL时，细胞存活率分别为75.88%，67.47%，50.73%和 45.76%，均显著低于对照组（p＜0.05）；两者对细胞增殖的影响均并呈现出显著的剂量-反应效应关系。经计算SeIV和SeMet的IC50分别为2.56、215.55 μg Se/mL，见表2、表3，对Caco-2细胞生长的抑制作用SeIV＞SeMet。且SeIV和SeMet对Caco-2细胞的毒性呈剂量依赖。这与此前研究结果相似，无机硒对HepG-2细胞的细胞毒性大于有机硒[11]，Takahashi[12]利用HepG-2研究硒对细胞毒性研究发现SeIV毒性强于SeMet，Hoefig[13]研究表明不同硒化物对细胞毒性作用的阈值存在一定差异，Lazard[14]研究表明不同的细胞系对硒化合物的敏感性不同。

表2 SeIV暴露对Caco-2细胞存活率的影响Table 2 Effect of SeIV on Caco-2 cell viability (n±6,)

表2 SeIV暴露对Caco-2细胞存活率的影响Table 2 Effect of SeIV on Caco-2 cell viability (n±6,)

注：*表示差异显著（p＜0.05）。下同。

Se 浓度/(μg/mL) 存活率/%0 100.61±7.77 0.4 75.94±7.04*2 74.10±12.84*4 36.82±5.34*8 19.29 ±6.89*

表3 SeMet暴露对Caco-2细胞存活率的影响Table 3 Effect of SeMet on Caco-2 cell viability (n±6,)

表3 SeMet暴露对Caco-2细胞存活率的影响Table 3 Effect of SeMet on Caco-2 cell viability (n±6,)

Se浓度/(μg/mL) 存活率/%0 100.61±7.77 40 75.88±6.84*80 67.47±2.11*160 50.73±8.32*320 45.76±5.67*

2.3 LDH释放率的测定

表4 SeIV暴露对Caco-2细胞LDH释放率的影响Table 4 Effect of SeIV on Caco-2 cell LDH release (n±4,)

表4 SeIV暴露对Caco-2细胞LDH释放率的影响Table 4 Effect of SeIV on Caco-2 cell LDH release (n±4,)

Se浓度/(μg/mL) 释放率/%0 14.80±2.01 0.8 35.72±1.45*4 80.73±4.18*8 85.83±3.39*

在体外的细胞实验中，LDH属于一种稳定存在细胞内部的酶，而当细胞遭受应激损伤后能迅速释放到细胞外，因此，细胞外液中的 LDH活性是衡量细胞发生应激损伤的指标物[15]。当SeIV浓度为0.8～8 μg Se/mL时，LDH释放率分别为 35.72%，80.73%和85.83%，均显著高于对照组（p＜0.05），见表4；SeMet浓度为 40～320 μg Se/mL时，LDH 释放率分别为28.39%，32.69%和 50.08%，均显著高于对照组（p＜0.05），见表5。在刘洋洋[16]等在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的实验中，在1.2～2.4 μmol/L范围内，SeMet处理的细胞LDH渗出比SeIV处理的细胞少，这说明不同形态的硒对肠上皮细胞 Caco-2细胞膜的损伤程度存在差异，表现为SeIV＞SeMet。

表5 SeMet暴露对Caco-2细胞LDH释放率的影响Table 5 Effect of SeMet on Caco-2 cell LDH release (n±4,)

表5 SeMet暴露对Caco-2细胞LDH释放率的影响Table 5 Effect of SeMet on Caco-2 cell LDH release (n±4,)

Se浓度/(μg/mL) 释放率/%0 14.80±2.01 40 28.39±9.51*80 32.69±2.23*160 50.08±10.31*

2.4 细胞中SOD活力和GSH含量的测定结果

作为机体内重要的抗氧化物SOD和GSH，在机体对抗氧化应激损伤的过程中发挥着相当重要的作用。SOD能够清除外源物质刺激产生的活性氧，减轻氧化物自由基对细胞质膜的毒害[17-19]。已有研究表明，SeIV可以刺激人急性早幼粒细胞白血病NB4细胞细胞内的活性氧物质生成，对NB4细胞造成损伤[20]。采用不同浓度的 SeIV处理大鼠口腔鳞癌细胞，细胞内的SOD活性随着SeIV浓度的增加而降低[21]。在本研究中，当SeIV浓度为4和8 μg Se/mL，SOD活性分别为40.43 U/mg prot和13.02 U/mg prot，Caco-2细胞的SOD活性均显著低于对照组（p＜0.05）；SeMet浓度40～160 μg Se/mL时，SOD活性分别为40.35 U/mg prot、23.24 U/mg prot和 9.39 U/mg prot，Caco-2 细胞的SOD活性均显著低于对照组（p＜0.05）。当SeIV浓度 4 μg Se/mL，GSH 含量为 31.40 μg/mg prot，Caco-2细胞GSH含量均显著低于对照组（p＜0.05）；而SeMet浓度则为160 μg Se/mL时，Caco-2细胞GSH含量（39.05 μg /mg prot）显著低于对照组（p＜0.05）。随着SeIV硒浓度的升高，细胞中的SOD活力和GSH含量成下降趋势，SeMet在较高浓度时，细胞中的SOD活力和GSH含量也明显下降，见表6、表7。这些结果说明，高于一定剂量的SeIV和SeMet可降低机体内源抗氧化系统活性，破坏细胞氧化与抗氧化之间的平衡从而导致氧化损伤的产生，造成细胞的活性下降和诱导凋亡。比较SeIV和SeMet，相同剂量下SeIV对肠上皮细胞Caco-2的氧化损伤能力高于SeMet。

GSH是细胞内的三肽物质，参与无机硒在细胞内代谢[22]，本实验结果显示，一定浓度（4～8 μg Se/mL）的SeIV显著降低Caco-2细胞内的GSH含量，最高浓度（160 μg Se/mL）的SeMet显著降低Caco-2细胞内GSH的含量。Cristina[23]的研究得到相似结果，不同浓度（1～50 μM）的SeIV处理增加了F36P细胞的GSH水平。但SeMet处理（5～500 μM），低浓度诱导谷胱甘肽水平下降，而高浓度诱导谷胱甘肽水平显著上升。Ganther和Kumari等人[24-26]研究发现，在体外实验中，SeIV在谷胱甘肽（GSH）的作用下被还原成氢化硒，Bao等[27]研究发现，细胞内产生的纳米硒引起的多重毒理效应是硒化物引起细胞毒性的原因之一，这与GSH参与硒的还原反应有密切关系，超过一定剂量的SeIV在细胞内与谷胱甘肽（GSH）进一步反应生成内生性纳米硒，细胞内GSH/GSSG比值降低以及蛋白质氧化和脂质过氧化的增加，硒纳米粒子的尺寸效应、边际效应引起细胞氧化还原失衡和氧化应激，加剧细胞凋亡或坏死[28]。

表6 SeIV对Caco-2细胞内SOD、GSH的影响Table 6 Effects of SeIV on Caco-2 cell SOD and GSH activity(n±4, )

表6 SeIV对Caco-2细胞内SOD、GSH的影响Table 6 Effects of SeIV on Caco-2 cell SOD and GSH activity(n±4, )

Se 浓度/(μg/mL) SOD/(U/mg prot) GSH/(μg/mg prot)0 56.76±3.64 61.67±4.73 0.8 48.62±7.41 54.27±3.47 4 40.43±2.30* 31.40±4.03*8 13.02±5.39* 27.90±1.45*

表7 SeMet对Caco-2细胞内SOD、GSH的影响Table 7 Effects of SeMet on Caco-2 cell SOD and GSH activity（n±4,）

表7 SeMet对Caco-2细胞内SOD、GSH的影响Table 7 Effects of SeMet on Caco-2 cell SOD and GSH activity（n±4,）

Se浓度/(μg/mL) SOD/(U/mg prot) GSH/(μg /mg prot)0 56.76±3.64 61.67±4.73 40 40.35±8.53* 64.05±8.78 80 23.24±6.85* 67.96±2.48 160 9.39±1.66* 39.05±4.39*

本实验中一定浓度的SeIV和SeMet均不同程度的降低Caco-2细胞的SOD活性和GSH的含量，并提高细胞外液的LDH活性（见2.3），说明高剂量的SeIV和SeMet均能破坏Caco-2的氧化还原平衡，损伤其细胞膜，进而诱导细胞凋亡。此前的研究表明，SeMet与 SeIV的细胞毒性可能是硒在细胞内还原而产生活性氧自由基（ROS和O2-·）导致，但是它们的毒性中心不同，SeIV的毒性中心为H2Se，SeIV在还原成H2Se的过程中降低谷胱甘肽比例（GSH/GSSG），并产生的ROS可诱导细胞的DNA损伤，导致细胞凋亡和坏死；而SeMet进入细胞后会生成硒代半胱氨酸（SeCys），进而生成硒代胱氨酸（SeCys2），SeCys2和SeCys的循环可产生ROS导致细胞氧化应激，并引起内质网蛋白错误折叠破坏细胞功能，有研究认为，SeCys可能是通过诱导蛋白质毒性而使细胞产生应激，这与无机硒诱导的DNA损伤不同[29-32]。

3 结论

硒是哺乳动物的必需的微量元素，但环境中过高的硒背景值和过量的摄入会对机体产生毒害作用。国家食品营养强化剂标准（GB14880-2012）中食物内硒的添加量为 0.03～0.280 mg/kg，添加剂为亚硒酸钠（SeIV）和硒酸钠（SeVI），远低于本研究的剂量范围。由于植物可将无机硒转化成硒蛋白储存，其硒蛋白组成主要为SeMet，近年来富硒农产品如富硒大米成为新的补硒手段，而对农产品进行外源添加无机硒或者有机硒是生产富硒农产品的主要途径。本研究对比了SeIV和SeMet的细胞毒性和氧化损伤能力，发现高于一定剂量的SeIV和SeMet均可不同程度地对细胞产生毒性，但是 SeIV的氧化损伤能力明显高于SeMet，因此在生产和销售富硒农产品的过程中，需加强对富硒农产品的硒含量和无机硒肥残留的检测，同时更需要关注农产品中有机硒和无机硒的占比。