基于网络药理学预测人参皂苷F2减肥作用的靶标及通路

周静，何洋，胡卫成，张迹，杨晓君

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

（2.淮阴师范学院江苏省区域现代农业与环境保护协同创新中心，江苏淮安 223300）

据世界卫生组织（World Health Organization，WHO）数据，截止到2016年，全世界18岁及以上的成年人中有39%的人群超重，其中13%为肥胖。肥胖可能增加罹患各种疾病的风险，如Ⅱ型糖尿病、高血压、脂肪肝、冠状动脉粥样硬化性心脏病等[1]，由肥胖引起的抑郁、自卑等心理问题也十分常见。肥胖主要源于遗传性、代谢失常、饮食结构失衡、缺乏体力活动等因素，基因水平上涉及多种调控通路，因此，开发多靶点化合物改善类似代谢疾病的研究受到广泛关注[2,3]。

人参（Panax ginseng）具有广泛的生理活性，如抗肥胖[4]、抑制肿瘤细胞生长[5]、调节机体免疫力[6]等，是一种重要的保健食品资源。人参皂苷是人参的主要功效成分，按结构主要分为原人参二醇型（protopanaxadiol，PPD）和原人参三醇型（protopanaxatriol，PPT）。人参皂苷 F2（20(S)-ginsenoside F2，G-F2）是由PPD型人参皂苷通过生物转化等方式水解多种糖苷键得到的，可以减轻氧化应激引起的细胞凋亡[7]，对胶质母细胞瘤[8]、乳腺癌[9]等有抗癌作用。有报道称G-F2可缓解胰岛素抵抗、保护肝免受非酒精性肝损伤，抑制肝内中性脂肪形成、堆积以及炎症[10]。笔者前期研究发现G-F2可以降低 3T3-L1前脂肪细胞脂滴产生数量，通过文献遍历，发现Fayeza Md. Siraj等[11]报道了G-F2可以抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化而可能具有减肥的效果，但是其作用机制尚不明确。

随着系统生物学、网络生物学、多向药理学等新兴交叉学科的发展，网络药理学（Network pharmacology，NP）已经成为未来功能成分开发的重要依据，它从整体性和系统性强调多成分、多靶点、多疾病之间的相互作用，提高效率，同时可以降低开发成本，也适用于天然产物研究与开发[12-14]。目前，NP已经发展出一系列成熟的数据平台、方法和软件，如可对中药成分进行筛选、获取成分-靶点-疾病关系的中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）；集成了包括基因组、转录组、蛋白质组、遗传、临床和功能信息等资源的 GeneCards；可以预测药物与蛋白质之间相互作用的STITCH数据库；用于分子互作网络及生物途径可视化的软件平台Cytoscape等[15]。

本研究采用网络药理学方法，利用公共数据库和已发表数据对 G-F2和肥胖的靶点进行预测和筛选，采用Cytoscape软件构建G-F2-靶点-疾病作用网络，对相关靶点参与的生物学过程、分子功能以及涉及的通路进行分析，以深入探讨 G-F2减肥的潜在作用机制，为后续研究提供参考方向。

1 资料与方法

1.1 G-F2靶点预测

在有机小分子生物活性数据库（PubChem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 检 索 20(S)-ginsenoside F2结构信息，再将获得的结构信息在小分子-蛋白靶点数据库（Swiss Target Prediction，http://www.swisstargetprediction.ch/）中检索，获得 G-F2的靶点信息。

1.2 肥胖相关靶点预测

在GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）以obesity为检索词查找肥胖相关靶点信息，选取相关分数Relevance score≥5作为分析靶点。将G-F2与肥胖相关靶点信息进行比对并取交集，即为 G-F2治疗肥胖潜在作用靶点。

1.3 靶点GO富集及KEGG通路注释分析

将G-F2-肥胖相关靶点信息导入OmicShare平台（https://www.omicshare.com/）GO富集和Pathway富集分析工具，制作GO富集柱状图、KEGG注释图，并选取Q-value前20的富集通路制作KEGG气泡图和通路-靶点网络图。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将 G-F2-肥胖相关靶点信息导入 String数据库（https://string-db.org/），选择Multiple Proteins选项，Organism选择为Homo Sapiens，再将获得的文件信息导入 Cytoscape version 3.7.0软件（Cytoscape Consortium, California，USA），绘制相互作用网络并分析，即获得靶点基因对应的蛋白质互作（PPI）关系图。

1.5 数据处理

本研究所有数据均使用Cytoscape version 3.7.0软件做图，选取P-Value＜0.01的数据进行 GO 富集及KEGG通路分析。

2 结果与分析

2.1 G-F2抗肥胖作用靶点筛选

G-F2化学结构见图3（a）。Swiss Target Prediction数据库共获得100个G-F2相关靶点信息，GeneCards数据库检索共获得 1367个肥胖相关靶点（Relevance score≥5），将 G-F2靶点信息与肥胖靶点信息进行比对，并取交集，共获得35个G-F2与肥胖相关靶点，见表1。

表1 G-F2减肥靶点Table 1 Anti-obesity targets of G-F2

2.2 G-F2抗肥胖潜在靶点GO富集分析

使用 OmicShare平台对G-F2-肥胖靶点进行GO富集分析。GO富集分析分别描述了靶点基因参与的生物过程（Biological Process）、分子功能（Molecular Function）、细胞组分（Celluar Component）。结果如图1所示。

由图1知，G-F2减肥作用的预测靶点参与多个生物过程，其中生物学过程主要包括代谢过程（metabolic process）、对刺激反应（response to stimulus）、生物调节（biological regulation）、细胞进程（cellular process）、多细胞组织过程（multicellular organism process）等；分子功能主要富集于结合（binding)、催化活性（catalytic activity）、分子转导活性（molecular trancducer activity）、分子功能调节（molecular function regulation）、转录调节活性（transcription regulation activity）等；参与的细胞组成主要包括细胞（cell）、细胞组分（cell part）、细胞膜（membrane）、细胞器（organalle）、细胞器组分（organelle part）等。

脂质代谢与能量代谢是肥胖发展的关键代谢过程。脂肪组织是能量储存、调节能量平衡和葡萄糖稳态的主要部位，分为白色脂肪组织和棕色脂肪组织，前者以甘油三酯的形式储存能量，其过量增加会导致激素紊乱、炎症细胞因子和脂肪因子的释放，是引起肥胖并导致一系列心血管疾病的重要因素[16]；而后者主要通过产热调节能量，维持正常能量稳态，因此，白色脂肪组织向棕色脂肪组织的转化对于改善肥胖具有重要意义，而这一过程与线粒体数量、形态、内膜上解偶联蛋白1（uncoupling protein-1，UCP1）、膜电位等因素相关，而预测靶点STAT3能够进入线粒体，调节电子传递链，增加线粒体ATP生成并减少组织损伤[17]。据报道，G-F2可通过降低线粒体膜电位、促使活性氧积累并诱导胃癌细胞凋亡而具有抗癌作用[18]，其是否对脂肪细胞线粒体产生影响有待实验验证。

2.3 G-F2抗肥胖潜在靶点KEGG通路富集分析

为了阐明G-F2减肥的作用机制，将上述32个潜在靶点进行KEGG通路富集分析注释，并取Q-Value前20的KEGG通路绘制气泡图，结果如图2所示。

图2（a）中对G-F2减肥潜在靶点进行了通路注释，结果显示这些靶点基因主要富集于六大模块，按节点degree排序位于前三的模块包括：（1）人类疾病，包括传染性疾病（infectious diseases）、癌症、抗药性（drug resistance）、内分泌代谢性疾病（endocrine and metabolic diseases）、心血管疾病（cardiovascular diseases）等；（2）环境信息进程，包括信号转导（signal transduction）、信号分子和相互作用（signaling molecules and interaction）；（3）有机系统，包括免疫（immune）、内分泌（endocrine）、神经（nervous）、环境适应（enviroumental adaptation）等。

图 2（b）中，“Rich factor”表示某一通路的靶基因数量与该通路上标注的基因数量之比，其值越高，富集程度越高。由图 2（b）（c）可知，G-F2发挥抗肥胖作用的潜在信号通路主要包括EGFR抗酪氨酸激酶抑制剂信号通路、P13K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路等。其中，EGFR是一种酪氨酸激酶，参与调节细胞内稳态，也是肿瘤细胞生长的刺激因子，而酪氨酸激酶抑制剂耐受（EGFR TKI resistance）则可导致肿瘤复发[19]，Li等[20]报道了小分子EGFR拮抗剂改善了肥胖引起的心肌损伤，降低了肥胖小鼠模型心肌炎症、纤维化、凋亡和功能障碍，这表明 G-F2在抗肥胖的同时可能通过该通路具有改善肥胖引起的心肌炎症作用，涉及的潜在靶点包括VEGFA、MAPK1、STAT3、MTOR、RPS6KB1、PIK3CA、FGF2、MET等8个靶点；PI3K-Akt信号通路调节基本细胞功能，如转录、分化、生长、存活等，是调控血糖平衡的关键通路[21]，涉及的靶点主要包括IL2、VEGFA、HSP90AA1、MAPK1、MTOR、RPS6KB1、PIK3CA、PIK3CG、PTPN1、MET等10个靶点；神经活性配体-受体相互作用通路涉及的靶点主要包括ADRA2A、ADRA2B、ADORA1、NR3C1、ADRB2、PLG、F2、HTR2A、HTR2B等9个靶点。关于 G-F2减肥作用的研究报道较少，值得对该预测结果作进一步深入实验验证。

图1 G-F2减肥潜在靶标GO富集分析Fig.1 Enriched gene ontology terms of potential anti-obesity targets from ginsenoside F2

图2 G-F2减肥潜在靶点KEGG通路富集分析Fig. 2 KEGG pathway enrichment analysis in potential anti-obesity targets of G-F2

2.4 G-F2-靶点-肥胖蛋白互作（PPI）网络模型分析

PPI网络图显示了靶点间直接或间接调控作用，可以更好的理解复杂代谢性疾病（如肥胖）中不同靶点的功能[22,23]。图3b中，节点（node）表示G-F2-肥胖相关靶点蛋白，其大小、颜色表示作用强度（degree），由橙至蓝，degree依次增大；节点之间的边（edge）表示靶点蛋白之间作用关系。靶点筛选共得到35个G-F2-肥胖相关靶点，而在图中显示32个节点，缺失的 3个靶点蛋白为 SLC5A1、ALDH2、HSD17B1，它们与其他靶点蛋白之间无相互作用关系，故不显示。由图可知，32个靶点蛋白共产生151条边，其中degree值位于前五的靶点分别是VEGFA（血管内皮生长因子A）、MAPK1（丝裂原活化蛋白激酶1）、CASP3（半胱天冬蛋白酶3）、STAT3（信号转导子和转录激活子3）、PIK3CA（磷脂酰肌醇3激酶），预示这些靶点可能是G-F2治疗肥胖的关键靶点。

图3 G-F2减肥潜在靶点PPIFig. 3 Protein interaction network of ginsenoside F2 in anti-obesity

肥胖在细胞水平表现为脂肪细胞数目增多、体积增大，其中，前脂肪细胞过度增殖与分化是引起肥胖的重要原因，期间受多种激素、基因表达和信号通路的调控[24,25]。PPARγ是脂肪细胞分化的重要转录子，它可促进脂肪细胞分化、脂肪生成并增加胰岛素敏感性，Fayeza Md. Siraj等[11]通过分子对接和体外实验发现G-F2与PPARγ具有良好亲和力，G-F2通过抑制PPARγ表达而阻止脂肪细胞分化，具有减肥活性，本研究基于此报道进行了 G-F2减肥靶点预测，进一步探讨其可能的分子机制。VEGF家族可参与血管形成、调节血管通透性、维持血管生理功能，研究表明其水平与肥胖呈正相关，而VEGFA在脂肪发育和能量代谢中起重要调节作用[26]，可能是G-F2减肥作用的重要靶点。MAPK作为预测的另一重要靶点，是细胞增殖、分化等基本细胞进程中起关键作用的胞内靶点[27,28]，Seo等[29]对槲皮素的体内外研究发现，它可以通过抑制脂肪细胞中MAPK信号因子ERK1/2、JNK、p38的表达而对肥胖及肥胖引起的炎症具有抑制作用。

3 结论

本研究通过网络药理学结合文献预测了 G-F2减肥的作用机制，建立了G-F2-靶点-肥胖作用网络，共涉及 35个潜在靶点，其中关键靶点包括 VEGFA、MAPK1、CASP3等，主要参与代谢、结合、组成细胞组分等生物过程，可能通过EGFR抗酪氨酸激酶抑制剂信号通路、P13K-Akt信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路等方式发挥改善肥胖作用，表明 G-F2具有多靶点、多通路的作用特点，为后续深入探讨 G-F2改善肥胖作用机制提供方向，网络药理学的研究思路也有助于传统药食资源的再开发利用。