典型底物对再生水中铁细菌生长的影响研究

许萍，赵晨，张丽

(教育部城市雨水与水环境重点实验室 水环境国家级实验教学示范中心 北京建筑大学，北京 100044)

将城市再生水作为工业冷却补充水是目前世界各国解决城市缺水问题的主要措施，而其带来的微生物腐蚀问题也引起了广泛的关注[1]。相较于自来水，再生水含有更多的有机物以及氮、磷物质，更有利于微生物的生长繁殖。铁细菌是造成金属腐蚀的主要微生物之一。

铁细菌包括铁氧化细菌(IOB)和铁还原细菌(IRB)，其中IOB菌能将二价铁氧化成三价铁，并从中获取能量[2]；随后，Fe3+以氢氧化物的形式沉积,并引起各种腐蚀[3-4]。且IOB菌有助于其他微生物在碳钢表面的定殖[5]。而IRB在厌氧环境下可以将三价铁作为电子受体进行厌氧呼吸，从而将三价铁还原回二价铁。

在国内外研究中发现，铁细菌的种类直接影响了其对金属腐蚀是促进[6-7]还是抑制作用[8-9]，铁细菌的数量直接影响了其作用程度。但现有研究中对水质因素影响铁细菌数量及种群结构的研究较少[10-11]。本研究期望通过探究再生水中不同底物对铁细菌生长附着和群落结构的影响，以期对控制微生物腐蚀提供一些理论依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

碳酸氢铵、磷酸氢二钾、氯化铁、丙酮、无水乙醇等均为分析纯；再生水，取自某城市再生水厂，用超纯水稀释10倍、紫外灯灭菌12 h后备用；铁细菌，根据GBT 14643.6—2009《工业循环冷却水中菌藻的测定方法 第6部分：铁细菌的测定 MPN法》，在再生水的铁细菌检测过程中，收集阳性试管，通过铁细菌培养基在同样条件下富集培养，得到浓度较高的铁细菌富集液。

生化培养箱；便携式溶解氧测定仪；分光光度计(具20 mm比色皿)等。

1.2 试片准备

试片为国家Ⅰ型标准腐蚀挂片(5 cm×2.5 cm×0.2 cm)，材质为20#碳钢。

试片首先用滤纸清洁，然后用丙酮清洁去除油脂，将其浸入无水乙醇中，使用脱脂棉擦洗2遍，再移入清洁的无水乙醇中浸泡片刻，使用脱脂棉擦干，用滤纸包裹于干燥器中干燥24 h备用。

1.3 实验方法

选择氨氮、总磷、总铁作为研究对象，每种底物设置4个浓度梯度，实验工况设置见表1。

表1 实验工况设置Table 1 Setting of test conditions

由表1可知，平行设置3组共12个锥形瓶；在每个锥形瓶中，挂入处理后的碳钢片，加入1 mL富集好的铁细菌，用无菌膜密封，放入生化培养箱中，在30 ℃下进行培养。

在第0，1，4，8，16 d时，对水样中与碳钢挂片表面的铁细菌数量、氨氮浓度、总磷浓度以及总铁浓度进行检测，对水样中的溶解氧进行检测，并对第16 d碳钢挂片上生物膜群落结构进行DNA测序。其中，铁细菌数量检测方法为MPN计数法(GB/T 14643.6)，氨氮、总磷、总铁的分析方法分别为纳氏试剂光度法(HJ 535—2009)、钼酸铵分光光度法(BG 76002—90)和邻菲罗啉法(GB/T 8570.7)，溶解氧采用便携式溶解氧测定仪检测，DNA测序具体方法是使用 16 s 通用引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，回收16 s片段，连接PMD-19T载体，挑选阳性克隆进行单向测序。

2 结果与讨论

2.1 氨氮对铁细菌生长的影响

不同氨氮初始浓度下，水溶液中悬浮铁细菌与碳钢挂片上附着铁细菌数量随时间的变化见图1。

图1 不同初始氨氮浓度下铁细菌数量的变化Fig.1 Changes in the amount of iron bacteria under different initial ammonia nitrogen concentrations

由图1可知，在初始浓度为0.4,0.8,1.2 mg/L的工况中，再生水中悬浮态铁细菌的数量基本上都在第1 d就达到了峰值，其中0.8 mg/L工况下最高，为925 CFU/L，是0.4 mg/L工况的2.9倍，也比1.2 mg/L工况高出125 CFU/L。说明当浓度在0.8 mg/L及以下时，氨氮是再生水中悬浮态铁细菌生长的限制性底物，增加氨氮浓度，会加速悬浮态铁细菌的繁殖；但当浓度超过0.8 mg/L以后，铁细菌的生长已不再受氨氮浓度的限制，此时随着氨氮浓度的增加，铁细菌的数量不再增加，甚至出现了略有下降的情况。

附着态铁细菌数量变化规律与悬浮态类似，也是在0.8 mg/L工况时出现了最高峰值，但是峰值在第4 d才出现，时间明显滞后。挂片上的氨氮主要来自于水溶液，而氨氮在挂片上的附着积累需要一定的时间，因此导致了附着态铁细菌出现增长滞后现象。图2中挂片上氨氮浓度随时间的积累规律也证明了这一点。

图2 不同初始浓度下氨氮浓度的变化Fig.2 Changes in ammonia nitrogen concentration under different initial ammonia nitrogen concentrations

由图2可知，随着时间的延长，再生水中的氨氮浓度持续下降，但碳钢挂片上的氨氮浓度却不断增加；到第8 d时，出现了挂片上的氨氮浓度高于溶液中的现象；至实验结束时，挂片上的氨氮浓度已分别是溶液中的2～12倍。这说明碳钢挂片上的生物膜与腐蚀产物层对氨氮具有明显的富集作用。靳军涛[12]的研究发现，腐蚀瘤内的离子浓度比溶液中的浓度高8倍以上，与本研究结论类似。

由图1可知，无论是悬浮态还是附着态，铁细菌数量在达到峰值后均出现了快速降低的现象，初期的下降速率高达50%～60%，说明铁细菌出现了大量死亡的现象。结合图2，0.8 mg/L工况下第4 d时水中的氨氮浓度为0.452 mg/L，比第1 d时降低了40%，此时氨氮浓度已成为制约铁细菌生长繁殖的限制因素，这是导致水中悬浮态铁细菌数量下降的主要原因。但是与水溶液中不同的是，在挂片上附着态铁细菌，在氨氮浓度持续增加的情况下，仍然出现了急剧下降的情况，说明有其他限制因素造成了附着态铁细菌的死亡。进一步测试水中溶解氧浓度发现，0.8 mg/L的工况下，第4 d时，水中的溶解氧已由7.555 mg/L降低至0.572 mg/L，考虑到挂片上生物膜、腐蚀产物层的影响，挂片上的溶解氧浓度更低。Lv等[13]研究发现，铁氧化菌的存在会消耗溶解氧。这也说明，如果挂片上主要是铁氧化细菌，则溶解氧浓度的大幅降低将会制约铁氧化菌的生长，甚至导致死亡。

2.2 总磷对铁细菌生长的影响分析

不同总磷初始浓度下，水溶液中悬浮铁细菌与碳钢挂片上附着铁细菌数量随时间的变化见图3。

图3 不同初始总磷浓度下铁细菌数量的变化Fig.3 Changes in the amount of iron bacteria under different initial phosphorus concentrations

由图3可知，加入总磷后，各工况再生水中的悬浮态铁细菌数量均迅速攀升，均在第1 d就达到了峰值；但是峰值高低与总磷浓度成反比，在0.5 mg/L 时最高，为1 000 CFU/L，当总磷浓度提升3倍达到1.5 mg/L时，悬浮态铁细菌的数量却下降了65%；当总磷浓度提升15倍，达到7.5 mg/L时，悬浮态铁细菌数量虽然较1.5 mg/L时略有上升，但仍比0.5 mg/L工况下低了50%。说明当浓度为0.5 mg/L或更低时，总磷是再生水中悬浮态铁细菌生长繁殖的限制性底物；但当浓度高于0.5 mg/L后，则会抑制悬浮态铁细菌的增长，这跟再生水中磷的迁移转化过程有关。

图4 不同初始浓度下总磷浓度的变化Fig.4 Changes in phosphorus concentration under different initial phosphorus concentrations

由图4可知，各种工况下，水溶液中的总磷均随着时间的延长快速降低，其中第1 d下降最快，除了7.5 mg/L工况为63%外，其他工况的下降率均达80%以上。对比图2可知，氨氮工况同期的下降率仅为5%～20%。再生水中的磷，除了少量被挂片吸收富集外，一部分作为营养物质被铁细菌吸收利用，另一部分以磷酸盐的形式与二价、三价铁离子反应，生成难溶的磷酸盐沉淀[14]。由图4可知，0.5 mg/L工况第8 d时，再生水中的总磷浓度已不足0.01 mg/L，但结合图3，此时悬浮态铁细菌数量仍然有583 CFU/L，说明较低的总磷浓度即可以满足铁细菌生长繁殖的需要，因此再生水中总磷浓度的快速降低主要是化学反应所致。随着水溶液中总磷浓度的提高，磷酸盐沉淀生成速度加快，一方面会大量消耗水中的铁离子，使悬浮态铁氧化细菌不能获得充足的金属基质而死亡[15]；另一方面，磷酸盐沉淀结构致密[16]，也会阻碍挂片上溶解氧的传递，减缓铁离子的溶出，从而对附着态铁细菌的群落结构和数量产生影响。

由图4可知，总磷工况中附着态铁细菌数量的最高峰值，跟氨氮工况一样，也出现在第4 d；但不同的是，随着再生水中总磷浓度的增加，附着态铁细菌的数量持续增多，并没有出现下降的现象，其中7.5 mg/L工况下的附着态铁细菌数量，在峰值时比其他工况高出了1.7～4.5倍。由图4可知，水溶液中总磷浓度越高，在挂片上累积的总磷浓度也越高，7.5 mg/L工况第4 d时的挂片上总磷浓度为0.055 mg/L，是其他工况的5～6.9倍，这是导致其附着态铁细菌数量最多的主要原因。

对比图1和图4挂片上的附着铁细菌数量发现，总磷7.5 mg/L工况下的铁细菌数量，较氨氮0.8 mg/L工况高出1倍多；同时，两工况下的溶解氧测试结果表明，总磷7.5 mg/L工况第4 d时的溶解氧含量为0.3 mg/L，是氨氮0.8 mg/L工况同期数值的52%；考虑到磷酸盐沉淀致密性结构对氧传质过程的阻碍，总磷工况下挂片内的溶解氧浓度将更低。这说明总磷工况中附着铁细菌的新陈代谢过程，对溶解氧的依赖程度较轻，有可能以铁还原细菌为主。

此外，对比图2和图4发现，水溶液中总磷为7.50 mg/L时，第4 d时挂片上的累积浓度为0.05 mg/L，后者是前者的0.7%；而当水溶液中氨氮为0.80 mg/L时，第4 d时挂片上的累积浓度为0.25 mg/L，后者则是前者的28%；即使到第16 d，挂片上的最高磷浓度也仅为水溶液中的15.4%，远低于氨氮工况的53.5%。考虑本研究中挂片上的底物测试样本均取自浸泡腐蚀产物后的上清液，不包含腐蚀产物本身，因此实质上的测试结果均为溶解态物质的含量。研究中出现的挂片上总磷含量低的原因，有可能是由于磷主要以不溶态形式存在而造成的。有研究发现，腐蚀产物中Fe(OH)2和Fe(OH)3的单核水合物及其进一步缩合形成的不同形态的多核络合物，均具有较多的正电荷和较大的比表面积，有利于吸附并沉淀磷[14]；Mohagheghi等也发现，在低浓度氯化物溶液中，磷酸氢二钾会被吸附在腐蚀产物表层，形成以FeHPO4和Fe3(PO4)2为主要形式的磷酸铁络合物[17]。这些研究也从不同侧面证实了本研究的上述推论。

2．3总铁对铁细菌生长的影响分析

不同总铁初始浓度下，水溶液中悬浮铁细菌与碳钢挂片上附着铁细菌数量随时间的变化见图5。

图5 不同初始总铁浓度下铁细菌数量的变化Fig.5 Changes in the amount of iron bacteria under different initial iron ion concentrations

由图5可知，加入三氯化铁后，各工况再生水中的悬浮态铁细菌数量均迅速攀升，均在第1 d就达到了峰值；但峰值高低与总铁浓度成反比，在0.1 mg/L时最高，为920 CFU/L，当总铁浓度提升90倍达到9.0 mg/L时，悬浮态铁细菌峰值数量最低，比0.1 mg/L工况低了65%。说明当浓度为0.1 mg/L或更低时，总铁是再生水中悬浮态铁细菌生长繁殖的限制性底物；但当浓度高于0.1 mg/L后，则会抑制悬浮态铁细菌的生长。溶液中的铁氧化细菌是通过将Fe2+氧化成Fe3+而获得能量生长繁殖的，当增加三氯化铁投加量后，水溶液中的Fe3+含量升高，不利于铁氧化细菌的生长繁殖。谭向东的研究也发现，过多Fe3+不利于铁细菌的生长，与本文结论一致[18]。

由图5可知，附着态铁细菌数量的最高值出现在1.6 mg/L工况下；与氨氮和总磷工况相同的是，各工况下的附着态铁细菌也均在第4 d出现峰值，且其后随着时间的延长，铁细菌的数量也持续降低。

不同初始浓度下，水溶液中和挂片上总铁浓度随时间的变化见图6。

图6 不同初始浓度下总铁浓度变化Fig.6 Changes in iron ion concentration under different initial iron ion concentrations

由图6可知，与氨氮、总磷工况相比，总铁工况也出现了水溶液中浓度随时间的延长持续下降、挂片上则持续上升的现象；但与氨氮、总磷工况不同的是，总铁工况中出现了挂片上底物浓度高于初始投加浓度的现象；实验结束时，0.1,0.8,1.6 mg/L工况下，挂片上的总铁浓度分别是溶液中初始浓度的14,2,1.6倍。究其原因，挂片上的氨氮、总磷，主要来自于生物膜、铁氧化物及其水合物对溶液中底物的吸收；挂片上的总铁，除了上述作用外，还含有因基体腐蚀而溶出的铁，这些铁一部分转化成腐蚀产物附着在挂片上，另一部分则在腐蚀产物、生物膜的阻隔作用下，在挂片上形成了铁离子溶液层[12]。

2.4 铁细菌生物膜群落结构研究

氨氮、总磷、总铁工况下，挂片上铁细菌的DNA测序结果见表2。

由表2可知，在检出的微生物中，氨氮工况下铁细菌的比例最高，为83.67%，高于总磷工况的62.20%，总铁工况的65.93%。说明3种底物中，氨氮更有利于促进再生水中铁细菌的生长繁殖；而总磷、总铁的加入，在促进铁细菌生长的同时，也在一定程度上促进了其他微生物的生长。

表2 不同工况下挂片上铁细菌的DNA测序结果Table 2 DNA sequencing results of iron bacteria on the slide under different working conditions

对比3种工况下的菌属发现，氨氮工况的铁细菌分属于5个菌属，其中4个是IOB菌属，且其菌数占比高达75.51%，占绝对优势，说明氨氮工况非常适宜IOB的生长，也证实了2.1节中关于溶解氧消耗殆尽是导致挂片上附着态铁细菌数量快速下降原因的推论。

总磷工况的铁细菌，分属于7个菌属，与氨氮工况相比，菌属种类更为多样；其中有3个是IRB菌属，菌数占比为50.95%；另外4个是IOB菌，菌数占比仅为11.25%；说明总磷工况更适宜于IRB菌的生长。IRB为厌氧自养菌，可以在近乎厌氧的环境下生长，这与2.2节中的研究结论一致；同时，该结果也从另一个侧面解释了磷具有的缓蚀作用。

总铁工况下的铁细菌也分属于7个菌属，其中2个是IRB菌属，5个是IOB菌属；IOB、IRB的菌数占比分别为38.22%和27.71%，与氨氮和总磷工况相比，两者的比例较为接近，说明该工况均可有效支持这两种菌的生长繁殖。

在3种工况下均检出了鞘脂单胞菌属和沉积物杆状菌属；其中，鞘脂单胞菌属为IRB菌，在氨氮工况中菌数占比为8.16%，远低于总磷工况的24.53%、总铁工况的23.40%；沉积物杆状菌属在 3种 工况下的菌数比则较为接近，分别是4.08%，3.77%，4.28%。鞘脂单胞菌是贫营养环境中常见的微生物，上述结果说明总磷、总铁工况比氨氮工况更有利于鞘脂单胞菌属微生物的生长。沉积物杆状菌属微生物通常位于生物膜的底层，在3种工况下环境条件类似，因此数量相对稳定。

3 结论

(1)氮、磷、铁3种底物下，各工况的水中悬浮态铁细菌峰值均出现在第1 d，附着态铁细菌峰值均出现在第4 d。当水中初始氨氮浓度为0.8 mg/L、总磷浓度为0.5 mg/L、总铁浓度为0.1 mg/L以及以下时，氨氮、总磷、总铁对于再生水中悬浮态铁细菌的生长繁殖菌具有明显的限制作用。

(2)碳钢挂片对于3种底物具有显著的富集作用，挂片上氨氮、总磷、总铁浓度随时间的延长不断增加；实验结束时，挂片上的氨氮浓度是同期溶液中浓度的2～12倍，总铁浓度超过了初始投加浓度，是其1.6～14倍。

(3)3种底物下，挂片上的铁细菌种群结构存在显著差异。氨氮工况下IOB菌占绝对优势，总磷工况的优势菌种则是IRB菌；在总铁工况中，IOB占比略高，但与IRB菌占比间的差异不显著。