沉默Ttf1 对神经元细胞及雌性大鼠弓状核内Kiss1 和GnRH基因表达的影响

臧少莲，尹小琴，吕拥芬，许丽雅，郭 盛，李 嫔

上海交通大学附属儿童医院，上海市儿童医院内分泌科，上海200333

青春期是生长和发育的关键时期，该阶段的正常发育依赖于正常的神经内分泌功能。下丘脑-垂体-性腺（hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG）轴调控人类的青春期发育和生殖功能，并且由兴奋性和抑制性因子组成的复杂网络严格调控，在胚胎期和婴幼儿早期阶段激活，在儿童期受到抑制，青春期开始时被重新激活并达到高潮[1]。促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）神经元的调控机制非常复杂，迄今为止关于青春期起始GnRH 神经元被激活的具体机制尚不清楚。亲吻素（KISS1）是Kiss1 基因编码产生的一种肽类激素，已有研究证实，KISS1 蛋白与G 蛋白偶联受体54（G-protein-coupled receptor 54，GPR54）是调节GnRH神经元活性和青春期发育的关键调节因子[2]，主要分布在下丘脑的前腹侧室旁核（anteroventral periventricular，AVPV）和弓状核（arcuate nucleus，ARC）[3]。雌激素是调节雌鼠下丘脑Kiss1 表达的关键因子，在AVPV 中它通过激活表达KISS1 神经元上的雌激素受体α（estrogen receptor α，ERα），正反馈促进GnRH 神经元分泌黄体生成素（luteinizing hormone，LH），刺激排卵；而在ARC中，雌激素则通过负反馈抑制KISS1 的释放。ARC 和AVPV 共同作用产生LH 的脉冲式释放，形成稳定的生殖 周期[4-5]。

甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1），又称为NK2 相关的同源转录因子1（NK2-related homeobox transcription factor 1，Nkx2-1）或甲状腺特异性增强子结合蛋白（thyroid-specific enhancer-binding protein，T/ebp），主要在前脑、垂体、肺和甲状腺等器官中表达[6]。Sandberg 等[7]研究发现TTF1 可以通过直接结合靶基因附近的调控元件而充当转录激活因子和抑制因子的角色。近年的研究[8]表明，TTF1 可能是Kiss1 上游的调控因子，通过直接调节Kiss1 的表达参与青春期性发育的调控。

敲除或敲低相关宿主基因对于研究细胞内关键分子的作用机制至关重要。慢病毒载体可以有效转导细胞，并稳定整合到宿主基因组中并长期表达，是长期基因传递的良好载体，因此慢病毒载体介导的RNA 干扰（RNA interference，RNAi）仍然被广泛使用[9]。为进一步证明TTF1 与青春期发育之间的关系，本研究设计并合成针对大鼠Ttf1 基因的干扰序列，构建有效慢病毒载体。在体外细胞水平测定慢病毒干扰效率后，进一步在体内利用脑立体定位技术将LV-TTF1-shRNA 原位注射至雌性大鼠下丘脑ARC 中，靶向敲低ARC 内Ttf1 的表达，观察青春期性发育过程的变化以及对Kiss1 和GnRH 基因表达的影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象及实验材料

1.1.1 实验动物及细胞 3 周龄的健康清洁级雌性Sprague-Dawley 大鼠（50 ～60 g）由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[生产许可证号为SCXK（沪）2017-0005]，随机分为ARC 慢病毒注射组和ARC 病毒对照组，每组30 只。利用脑立体定位仪在大鼠ARC 内进行双侧显微注射。实验大鼠饲养于上海交通大学附属第六人民医院动物科学部[动物使用许可证号为SYXK（沪）2016-0020]，饲养条件为自然光照，平均温度（21±2） ℃，相对湿度（55±10） %，12 h 明暗周期，大鼠自由摄食 饮水。

人胚肾细胞293T 为贴壁依赖型上皮样细胞，神经母细胞ND7-23 为贴壁神经元细胞，2 株细胞均购自中国科学院细胞库；常规培养使用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM 培养液（含4.0 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素），于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。

1.1.2 主要试剂及仪器 内切酶、T4DNA 连接酶（1 U/µL）、DNA 标志物GeneRuler DNA Ladder、RNA 酶抑制剂（Fermentas，加拿大），TRIzol 试剂、反转录酶、DNA 聚合酶、dNTPs、转染试剂Lipofectamine 2000（Invitrogen，美国），凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒（Axygen，美国），包装质粒、空病毒载体PDS019_pL_shRNA_F（上海诺百生物科技有限公司），DMEM、Opti-MEM、0.25%胰蛋白酶、FBS（Gibco，美国），氯仿、异丙醇、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），DEPC 水、3-磷酸甘油 醛 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（上海翊圣生物科技有限公司），反转录试剂盒及实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）试剂盒（TaKaRa，日本），蛋白裂解液、ECL 发光试剂盒（ThermoFisher，美国），TTF1 抗体、KISS1 抗体（Abcam，英国），辣根过氧化物酶标记二抗（Jackson，美国），Western blotting 抗体快速剥离缓冲液（上海雅酶生物科技有限公司），戊巴比妥钠（Sigma，美国）。

10 μL 微量注射器（上海高鸽工贸有限公司），低温高速离心机（Eppendorf，德国），荧光显微镜（Leica，德国），实时荧光定量PCR 仪（Roche，瑞士），紫外分光光度计（ThermoFisher，美国），ChemiScope 3500 化学发光成像仪（上海勤翔科学仪器有限公司）。DNA 测序和引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 LV-TTF1-shRNA 慢病毒载体的构建 对Ttf1 基因序列（NM_013093.1）进行分析，检查基因内部有无特别复杂的二级结构和重复序列。然后采用Invitrogen 公司提供的在线设计工具（www.invitrogen.com/rnai）针对大鼠的Ttf1 基因设计3 对shRNA 引物序列（表1）。在序列的5'端添加限制性酶切位点及Kozak 序列GCCACC，在序列的3'端添加限制性酶切位点。将shRNA 引物混合溶液于95 ℃加热5 min，72 ℃退火5 min 后利用DNA 连接酶连接入空载体PDS019_pL_shRNA_F 中。

1.2.2 慢病毒质粒的包装 取对数生长期且细胞状态良好的293T 细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后吹打形成单细胞悬液，按照6×106个细胞数接种到10 cm 的培养皿中，次日将细胞完全培养液换成5 mL Opti-MEM 培养液。将9 µg 包装质粒和3 µg 慢病毒质粒加入1.5 mL Opti-MEM培养液中充分混匀；同时取36 µL Lipofectamine 2000 加入另外的1.5 mL Opti-MEM 培养液中，混匀后室温放置20 min。将这2 种液体混合后加入细胞培养皿中，轻轻混匀，置于细胞培养箱中孵育6 h 后，换成完全培养液（含10%FBS），继续培养48 h 后收集细胞培养液，1 000×g离心10 min，并用孔径0.45 μm 的滤器进行过滤。将过滤后的病毒原液50 000×g 超速离心2 h，移去上清液，加入1 mL DMEM 培养液进行重悬，并利用荧光法测定病毒滴度，然后按需分装至小管，置于-80 ℃冰箱中保存 备用。

1.2.3 LV-TTF1-shRNA 慢病毒转染ND7-23 细胞 将ND7-23 细胞培养于含10%FBS 的DMEM 培养液中。梯度稀释病毒原液后转染ND7-23 细胞，利用荧光显微镜观察不同病毒稀释度转染ND7-23 细胞后的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表达比例，从而确定慢病毒最佳转染浓度。将细胞分成空白对照组、阴性对照组（NC 组）、LV-TTF1-shRNA1 组、LV-TTF1-shRNA2 组、LV-TTF1-shRNA3 组进行慢病毒转染，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，弃病毒液，加入完全培养液，继续培养48 h，收集细胞沉淀用于qPCR 和Western blotting 检测慢病毒的干扰效率。

1.2.4 下丘脑核团内双侧显微注射 根据本课题组前期研究[10-11]，在大鼠21 日龄进行手术可使LV-TTF1-shRNA在青春期开始前达到最大表达量。将21 日龄雌性大鼠用1%戊巴比妥钠（0.5 mL/100 g）深度麻醉后，置于脑立体定位仪上，切开皮肤和骨膜以暴露前囟点。采用10 μL 微量注射器进行显微注射，并在其尖端再连接一段玻璃毛细管，以减小对大鼠脑部的损伤。将3 μL LV-TTF1-shRNA3慢病毒质粒（1.2×109TU/mL，LV 组）或LV-EGFP（即空病毒载体PDS019_pL_shRNA_F，NC 组）显微注射到大鼠ARC 中。注射后，将针头保留在原处5 ～10 min，然后在1 min 内缓慢取出，在对侧核重复该操作。实验过程中，参考Paxinos 等[12]的脑图谱和前期研究结果[13-14]，确定ARC 的立体坐标（外侧0.4 mm，前囟后1.6 mm，硬脑膜下9.6 mm）。术后于每日上午9:00—9:30 观察大鼠阴门开启情况。然后分别在大鼠幼年期（25 日龄）、青春发育早期（35 日龄）、成年期（42 日龄）腹腔注射过量的戊巴比妥钠实施安乐死，断头取脑，迅速分离ARC 核团，并保存于液氮中，用于测定RNA 和蛋白的表达。

1.2.5 qPCR 检测 使用TRIzol 试剂提取总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA 的浓度和纯度。每个样本取1 µg RNA 进行反转录（42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min）。qPCR 反应条件为95 ℃，3 min 变性；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，45 个循环。以β 肌动蛋白（β-actin）基因作为内参基因。各基因引物序列见表2。

1.2.6 Western blotting 检测 利用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液提取细胞或组织中的蛋白质，BCA 法测定各组蛋白质浓度，加热变性处理后进行Western blotting检测。10%（用于TTF1）或12%（用于KISS1）SDSPAGE 进行半干电泳后转移至PVDF 膜，转膜条件为200 mA、70 min。5%脱脂牛奶封闭1 h 后加入抗TTF1 抗体（1:500）、抗KISS1 抗体（1:400）或抗GAPDH 抗体（1:10 000），4 ℃振荡过夜；再加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:10 000），室温孵育1 h。用ECL 发光试剂盒进行化学发光检测，经显影处理后，胶片用凝胶成像分析系统拍照。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，GraphPad Prism 8.0.1 软件作图。多组间均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），并采用LSD 检验进行两两比较。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒侵染ND7-23 细胞后TTF1 的表达

慢病毒转染ND7-23 细胞72 h 后，在荧光显微镜下可见EGFP 表达（图1），证明转染成功。qPCR 结果（图2A）显示，NC 组与空白对照组相比，Ttf1 mRNA 表达差异无统计学意义。与NC 组相比，LV-TTF1-shRNA2 组和LV-TTF1-shRNA3 组Ttf1 mRNA 表达量显著下降（均P=0.000），TTF1-shRNA2 和TTF1-shRNA3 的干扰效率分别为54.54%和64.24%。Western blotting 结果（图2B）显示：NC 组与空白对照组相比，TTF1 蛋白表达量差异无统计学意义；与NC 组相比，LV-TTF1-shRNA2 组和LV-TTF1-shRNA3 组TTF1 蛋白表达显著降低（均P＜0.05），与PCR结果一致。根据对Ttf1 mRNA 和蛋白表达的抑制率，选择干扰效率最佳的TTF1-shRNA3 构建慢病毒载体并包装病毒，用于后续的动物体内下丘脑ARC 核团的注射。

图1 LV-TTF1-shRNA 慢病毒质粒转染ND7-23 细胞（×100）Fig 1 Transfection of ND7-23 cells with LV-TTF1-shRNA plasmid (×100)

图2 慢病毒质粒转染ND7-23 细胞72 h 后Ttf1 mRNA 和蛋白的表达量 Fig 2 Expressions of Ttf1 mRNA and protein 72 h after transfection of lentiviral plasmids in ND7-23 cells

2.2 LV-TTF1-shRNA3 慢病毒质粒侵染ND7-23 细胞后Kiss1 和GnRH 的表达

LV-TTF1-shRNA3 慢病毒质粒转染ND7-23 细胞72 h后，qPCR 结果（图3）显示：NC 组与空白对照组比较，Kiss1 和GnRH mRNA 表达差异无统计学意义；与NC 组相比，LV-TTF1-shRNA3 组的Kiss1 和GnRH mRNA 表达显著降低（均P＜0.05）。

2.3 慢病毒质粒在大鼠ARC 核团的原位注射

参考Paxinos 等[12]的脑图谱，利用脑立体定位注射仪，先通过注射蓝墨水确定ARC 核团位置（图4A、B），然后在双侧ARC 内显微注射LV-EGFP。雌鼠25 日龄时通过荧光显微镜在ARC 内观察到高密度表达EGFP 的细胞（图4C、D），在注射通道中也观察到一些少量的EGFP 表达。

图3 LV-TTF1-shRNA3 转 染ND7-23 细 胞72 h 后Kiss1 和GnRH mRNA 的 表达Fig 3 mRNA expressions of Kiss1 and GnRH in ND7-23 cells 72 h after LV-TTF1-shRNA3 transfection

图4 LV-EGFP 在大鼠下丘脑ARC 内的定位及表达Fig 4 Location and expression of LV-EGFP in the ARC in hypothalamus after LV-EGFP injection in the rats

2.4 大 鼠ARC 内 注 射LV-TTF1-shRNA3 后 对Kiss1 和GnRH 基因表达的影响

对21 日龄的雌性大鼠ARC 核团原位注射LV-TTF1-shRNA3 或LV-EGFP 后，分别于25 日龄、35 日龄、42 日 龄处死大鼠，分离ARC 核团。通过qPCR 检测大鼠ARC中Ttf1、Kiss1、GnRH mRNA 的 表 达。Ttf1 mRNA 在ARC 中显著降低（均P=0.000，图5A），Kiss1 和GnRH mRNA 也 显 著 降 低（均P＜0.05，图5B、C）。Western blotting 结果与qPCR 结果一致，在3 个不同发育阶段，LV 组的TTF1 蛋白表达显著降低，与NC 组相比，35 日龄和42 日龄时，LV 组KISS1 蛋白表达显著下降（均P＜0.05，图5D～F）。

2.5 大鼠ARC 内注射LV-TTF1-shRNA3 后对性发育的影响

21 日龄雌性大鼠ARC 内注射LV-TTF1-shRNA3 后，阴门开启时间较NC 组明显延迟（P=0.000，图6）。

图5 ARC 内注射LV-TTF1-shRNA3 后对Kiss1 和GnRH 表达的影响Fig 5 Effect of intra-ARC LV-TTF1-shRNA3 administration on the expressions of Kiss1 and GnRH

图6 ARC 内注射LV-TTF1-shRNA3 后对雌性大鼠青春期发育的影响（n=7）Fig 6 Effect of intra-ARC LV-TTF1-shRNA3 administration on female rat puberty (n=7)

3 讨论

2001 年，Lee 等[15]研究发现，中枢性性早熟会使得下丘脑病变部位附近的神经元TTF1 表达量增加。先前，Kimura 等[6]就发现，携带Ttf1 基因失活突变的小鼠下丘脑腹内侧核和背侧核发育停滞，第三脑室腹侧发生融合，缺乏弓状核。在哺乳动物青春期启动之前，下丘脑中Ttf1 mRNA 的表达会随着发育逐渐增加[15]。Kim 等[16]的研究发现，大鼠在26 ～27 日龄，即青春期启动之前，TTF1的表达会达到一个明显的峰值。这些研究结果表明TTF1不仅参与哺乳动物的青春期发育，还与下丘脑神经核团的发育密不可分，更加支持了TTF1 是由中枢控制青春期启动的重要成分。

本研究使用的ND7-23 细胞能够表达内源性TTF1，是研究TTF1 调控Kiss1 的良好体外模型。体外实验证实，在ND7-23 细胞内下调Ttf1 可以降低细胞内Kiss1 和GnRH 基因的表达。进而通过脑立体定位仪将LV-TTF1-shRNA 慢病毒质粒原位注射到21 日龄雌性大鼠下丘脑ARC 内，在青春期启动之前特异性干扰核团内Ttf1 的表达，观察其对雌鼠青春期发育的影响。手术完成4 d 后，通过冰冻切片，可以明显观察到ARC 内有EGFP 表达。脑立体定位注射将慢病毒质粒传递到细胞或哺乳动物体内，可使得目的片段在特定位置稳定并持续地表达；并且TTF1-shRNA 可以在雌鼠青春期内持续发挥干扰作用，且抑制Ttf1 表达后，不仅使得Kiss1 和GnRH 基因表达显著下调，而且也导致雌鼠阴门开放时间明显延迟。虽然前期有研究者使用Cre/Loxp 技术构建小鼠分化神经元内的Ttf1基因敲除动物模型[17]，小鼠也出现了青春发育延迟，但是Cre/Loxp 技术时间和价格成本较高，且胚胎期小鼠不易存活。因此我们通过脑立体定位注射慢病毒来研究Ttf1 对雌鼠青春期发育的影响及其分子机制，与体外实验结果一致，这也表明利用慢病毒载体持续沉默靶基因是一种研究影响青春期发育因素的有效方法。

综上所述，抑制下丘脑ARC 中Ttf1 的表达可以引起启动HPG 轴Kiss1 的表达减少和GnRH mRNA 的降低，从而延迟雌鼠阴门开放时间。TTF1 在青春期发育过程中起着重要的作用，本研究可能为儿童性早熟的治疗提供新的理论依据。

参·考·文·献

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