叶酸修饰的pH响应型固体脂质纳米粒*

王小宁，闫梦茹，梁晓燕，高迎春，马远涛

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种蒽环类广谱抗肿瘤药物，主要应用于肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌等的化疗，其疗效确切，但选择性差，心脏毒性严重，长期应用可发生剂量依赖性的不可逆转心肌病变，并造成骨髓抑制，使DOX的临床应用受到极大限制[1-2]。因此，提高DOX的肿瘤靶向性是目前亟待解决的问题。近年来，配体-受体模式的主动靶向给药系统备受关注，叶酸受体(folate receptor，FR)在许多人类实体肿瘤(卵巢癌、肾癌、子宫癌、结肠癌、肺癌)细胞表面过度表达，但在正常组织表达率很低，因此，利用叶酸(folic acid，FA)修饰药物或药物载体，通过与叶酸受体特异结合可将药物靶向投递到肿瘤组织[3-4]。固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是一种以室温下为固态的天然或合成的脂质或类脂，如卵磷脂、三酰甘油等为基质，将药物包裹于类脂核中制成粒径约为50～1 000 nm的固体脂质微粒给药体系[5-6]。固体脂质纳米粒的固体脂质形式有效解决了脂质体药物易渗漏的缺点，又避免了作为药物载体的物理不稳定性。同时，采用人体耐受良好的脂质材料，制备过程中不会引入有毒物，其生物相容性更好，毒性更低[7]。因此，固体脂质纳米粒是一种具有发展前景的新型给药系统。

聚(2-乙基-2-噁唑啉)[poly(2-ethyl-2-oxazoline),PEOz]是一种亲水性高分子材料，可以修饰在纳米粒子表面，增加其亲水性，形成立体位阻，使纳米粒躲过网状内皮系统的识别，避免被摄取清除，因此能够达到延长药物体内循环时间的目的[8]。同时，PEOz具有pH响应性，其分子中含有叔酰胺基团，容易结合溶液体系中的氢离子发生质子化，在酸性条件下，由于质子化后产生的静电斥力会使得PEOz链舒张，造成药物释放[9]。因此，作者制备一种叶酸与PEOz共同修饰的pH响应型固体脂质纳米制剂(SLN-PEOz-FA)作为新型的给药系统，以DOX为模型药物，采用薄膜分散法制备载药固体脂质纳米粒(DOX@SLN-PEOz-FA)，考察其包封率、载药量、粒径、体外释药性能，以人乳腺癌细胞(MCF-7)为细胞模型考察肿瘤细胞生长抑制率及细胞摄取情况，为肿瘤的靶向治疗提供理论依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

DOX：纯度>99%，美国Sigma-Aldrich公司；盐酸多巴胺：纯度>99%，上海萨恩化学技术有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、青霉素-链霉素(10000IU/mL青霉素-G和10 mg/mL链霉素)、含有各种氨基酸和葡萄糖的培养基(DMEM培养液)，美国Hyclone公司；泊洛沙姆188、单硬脂酸甘油酯、注射用大豆卵磷脂：药用级，天津市博迪化工有限公司；无水乙醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

电子天平：SQP，德国赛多利斯公司；集热式恒温加热磁力搅拌器：ZNCL-T1000，西安予辉仪器有限公司；台式低速离心机：WTL-6K，湖南湘仪仪器有限开发公司；超声波清洗器：KQ520E，昆山市超声仪器有限公司；真空干燥箱：DZF6050，温州鼎力医疗器械有限公司；激光粒度分析仪：Malvern，英国马尔文仪器有限公司；紫外-可见分光光度计：Cary60，安捷伦科技有限公司；酶标仪：680，美国BIO-RAD；倒置荧光显微镜：ix73，日本奥林巴斯公司。

1.2 固体脂质纳米粒的制备

1.2.1 DOX@SLN的制备

采用薄膜分散法进行阿霉素固体脂质纳米粒制备[10]。油相制备：精密称取大豆卵磷脂40 mg溶解于30 mL无水乙醇中，称取单硬脂酸甘油酯0.12 g在60 ℃下加热熔融，与上述溶液混合；水相制备：精密称取DOX 9 mg加入到20 mL质量浓度为0.1 mg/mL的泊洛沙姆188溶液中；将油相置于250 mL的茄型瓶中，50 ℃下旋转蒸发除去溶剂，得到油膜，加入20 mL的水相，超声处理40 min(功率为400 W)，得到SLN混悬液，4 ℃保存备用。

1.2.2 DOX@SLN-PEOz的制备

将制得的固体脂质纳米粒取14 mL加入14 mg的盐酸多巴胺，加入2 mL pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，用w(NaOH)=0.1%溶液调节至pH=8.5，在室温条件下避光搅拌24 h后，反应结束。继续加PEOz 5 mg在室温下避光搅拌2 h，即可得到PEOz修饰的固体脂质纳米粒，4 ℃避光保存备用。

1.2.3 DOX@SLN-PEOz-FA的制备

取PEOz修饰的固体脂质纳米粒7 mL置于烧杯中，避光称取5 mg叶酸加入，避光搅拌2 h，即可得到叶酸和PEOz共同修饰的DOX固体脂质纳米粒，4 ℃避光保存备用。

1.2.4 含量测定方法学考察

精密称取DOX 10 mg置于100 mL的容量瓶中，加去离子水完全溶解至刻度，作为标准储备液。分别精密量取该溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL置于10 mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，得到一系列质量浓度分别为2.0、5.0、10.0、20.0、30.0和40.0 μg/mL的标准液，在480 nm处测定吸光度，用吸光度A对质量浓度ρ作标准曲线，同时进行精密度、重复性及加样回收率考察。

1.3 粒径和Zeta电位

分别取1 mg DOX@SLN、DOX@SLN-PEOz和DOX@SLN-PEOz-FA，用去离子水稀释至10 mL，吸取2 mL稀释液加入激光粒度仪的样品池中，测定平均粒径及表面电位。

1.4 包封率和载药量

吸取2 mL DOX@SLN-PEOz-FA,在4 ℃条件下5 000 r/min离心40 min，分离上清液，吸取1 mL置于10 mL容量瓶中，用去离子水稀释定容，摇匀。以相同条件下制得的空白纳米粒的上清液为参比对照，在480 nm处测定吸光度，计算上清液中游离DOX的含量，按照公式(1)、(2)计算包封率和载药量。

包封率=[m(总DOX)-m(上清液中游离的DOX)]/m(总DOX)×100%

(1)

载药量=[m(总DOX)-m(上清液中游离的DOX)]/m(纳米粒)×100%

(2)

1.5 载药纳米粒的体外释放实验

分别精密移取SLN@DOX、DOX@SLN-PEOz和DOX@SLN-PEOz-FA各3份，每份吸取1 mL，加入到预先处理好的透析袋中，扎紧透析袋两端，悬浮于20 mL pH=5.0、6.5、7.4的PBS中，将其置于37 ℃恒温水浴锅中动态透析，分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24和48 h取透析袋外液1 mL，同时补充等量新鲜的PBS。测定样品吸光度值，依据公式(3)计算累计释放度(Q)。

(3)

式中：ρn为不同取样点时的释放液质量浓度，μg/mL；ρi为取样点时取样质量液浓度，μg/mL；V为释放介质体积，mL；Vi为取样体积，mL；m为总药量，μg。

1.6 细胞摄取实验

将MCF-7细胞3×105个/孔接种于6孔培养板，培养24 h。吸弃培养液，用无血清培养液漂洗，加入2 mL无血清培养液稀释的游离DOX溶液、DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz和DOX@SLN-PEOz-FA，使DOX的最终质量浓度为50 μg/mL。继续孵育4 h，孵育完毕后，吸弃含药培养液，用冷的PBS漂洗3次，除去未进入细胞的药物，然后加入w(多聚甲醛)=4%溶液，每孔1 mL，然后将细胞放入培养箱，培养30 min后，在超净台内吸去多聚甲醛溶液，用PBS清洗细胞3～5次，以清除多余的多聚甲醛，然后每孔加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(0.5 μg/mL)溶液1 mL，将细胞放入培养箱，培养15 min后，吸去DAPI溶液，用PBS清洗细胞3～5次，每孔加入500 μL，在倒置荧光显微镜下观察荧光并拍照，考察细胞摄取的变化情况。

1.7 体外细胞生长抑制率研究

将对数生长期的MCF-7细胞进行消化得到混悬液，用细胞计数板计数后接种于96孔板，接种的细胞密度为5×104个/mL，每孔加入100 μL细胞悬液，培养24 h。加入含有不同质量浓度载药粒子(游离DOX、DOX@SLN、DOX@SLN-PEOz、DOX@SLN-PEOz-FA)的培养液200 μL，使ρ(DOX)=125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、2.0和1.0 μg/mL，实验同时设空白对照组。每孔6复孔，培养24 h，每孔加入ρ(MTT)=5 g/L溶液150 μL，于37 ℃、φ(CO2)=5%的培养箱中培养4 h后，弃液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，振荡器上轻摇10 min，结晶溶解后，在酶标仪490 nm波长处测出细胞对照组和各实验组的吸光度A，以每孔6个孔的平均值作为各组的吸光度，重复实验3次，计算各实验组的存活率=A实验组/A对照组×100%，比较各个实验组在24 h后对MCF-7细胞的存活率。

1.8 统计学处理

2 结果与讨论

2.1 含量测定方法学

以DOX标准液的质量浓度ρ为横坐标x，吸光度A为纵坐标y，得回归方程为y=19.58x+0.007，R2=0.999 7，ρ(DOX)=0.002～0.040 mg/mL线性关系良好。精密度及稳定性实验结果表明，吸光度RSD<5%，精密度、稳定性符合要求，加样回收率实验结果表明，在低、中、高质量浓度范围内，回收率均为90%～110%，回收率良好。

2.2 粒径、分布及电位值

各载药制剂的粒径、分布及电位值见表1。

表1 各载药制剂的粒径、PDI和Zeta电位值

由表1可知，随着PEOz和FA的修饰，纳米粒子的粒径逐渐增大，粒径分布较为集中。DOX@SLN的Zeta电位值为-19.6 mV，PEOz修饰后，Zeta电位值为-13.8 mV，这可能是由于PEOz上有叔胺基引起，经FA修饰后，Zeta电位值为-18.4 mV，这是由FA上的羧基引起的。

2.3 载药量和包封率

按照1.4方法，计算载药量和包封率，得到结果见表2。

表2 各载药制剂的载药量和包封率

由表2可知，3种载药制剂的包封率均超过90%，为92.46%～94.17%，载药量为6.46%～9.31%。

2.4 体外释药

根据1.5方法进行体外释药实验，计算累计释放度(Q)，其释放结果见图1。

t/ha DOX@SLN-PEOz-FA在不同pH值释放介质中的释放

t/hb 3种制剂在pH=5.0下的释放图1 体外释放结果(n=3)

由图1a可知，DOX@SLN-PEOz-FA的释药具有明显的pH响应性，其在pH=7.4的释放介质中释药缓慢，24 h累积释放度为16.04%；在pH=6.5的介质中，释药加快，24 h累积释放度为40.62%；在pH=5.0的释放介质中，释药速率最快，4 h累计释放度达到了35.28%，24 h累积释放度为65.24%，这可能是由于PEOz结构中叔胺基的质子化造成PEOz链的“膨胀”，从而使得药物快速释放。由图1b可知，经PEOz修饰后，载药制剂的释药均具有pH响应性，且DOX@SLN-PEOz和DOX@SLN-PEOz-FA之间释药速率没有显著性差异。DOX@SLN-PEOz-FA的pH响应性释药特性有望实现药物在肿瘤细胞内的快速响应释放。

2.5 细胞摄取实验

MCF-7细胞对不同载药粒子的摄取结果见图2。

由图2可知，与游离DOX相比，DOX@SLN的细胞摄取率明显降低，这是由于DOX进入细胞是直接入核的。而DOX@SLN-PEOz-FA具有最高的细胞摄取，其在细胞内的荧光强度比DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz显著增强，说明SLN经FA修饰后，确实增强了MCF-7细胞的摄取，这是由受体-配体特异性识别的主动靶向作用引起的[11]。细胞摄取增强有助于其特异性作用于肿瘤细胞，从而增强对肿瘤细胞生长的抑制。

2.6 体外细胞生长抑制率研究

载药制剂对MCF-7细胞生长抑制率结果见图3，各载药制剂的IC50值见表3。

ρ/(μg·mL-1)图3 载药制剂对MCF-7细胞生长抑制率结果

表3 各载药制剂的IC50值

由图3可知，随着药物质量浓度的逐渐增大，各组载药制剂对细胞的抑制率增强。相同质量浓度下的DOX@SLN-PEOz-FA对肿瘤细胞生长的抑制率比DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz组更高，说明经叶酸和PEOz修饰后，载药制剂对肿瘤细胞生长的抑制作用更强。由表3可知，DOX@SLN-PEOz的IC50值为6.20 μg/mL，与DOX@SLN之间存在显著性差异(P<0.001)，这可能是由于PEOz修饰后释药速率加快，与体外释药结果一致，DOX@SLN-PEOz-FA的IC50最低，为3.36 μg/mL，与游离DOX、DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz之间均存在显著性差异(P<0.001)，说明经PEOz和FA双重修饰后，对肿瘤细胞生长的抑制作用最强，这是由于细胞摄取增强及胞内响应释药双重作用引起的。

3 结 论

(1)采用FA和PEOz对固体脂质纳米粒进行修饰，制得的固体脂质纳米粒平均粒径为(245.46±47.48)nm，包封率为(92.46±5.30)%，载药量为(4.46±0.17)%，体外释药特性研究结果表明，DOX@SLN-PEOz-FA具有明显的pH响应性；

(2)细胞摄取研究结果表明，与DOX@SLN和DOX@SLN-PEOz相比，DOX@SLN-PEOz-FA的细胞摄取显著增强，说明经FA修饰后，载体的入胞能力显著增强。体外肿瘤细胞生长抑制率研究结果表明，经PEOz和FA共同修饰的SLN增加了DOX的细胞毒性，肿瘤细胞的生长明显得到抑制。