盐酸环丙沙星载药β-环糊精聚合物的制备*

刘君如，张炯哲，杜 丹，苗延青，尤 静，杨黎燕

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

盐酸环丙沙星(Ciprofloxacin hydrochloride，Cip)是第3代喹诺酮类抗菌药物的代表，抗菌作用强、抗菌谱广、价格低廉、适用广泛，对耐药绿脓杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎军团菌、产青霉素酶淋球菌和产酶流感杆菌等有效，一些对第三代头孢菌素、氨基甙类等耐药的革兰阴性和阳性菌对该品仍表现出敏感[1-2]。中国抗生素使用量大，2013年抗生素使用量为162 kt，约占世界用量的50%[3]，近年来，喹诺酮类药物的滥用，使得其耐受性增加[4]。为了提高盐酸环丙沙星的抗菌性、降低刺激性和毒性及不良反应，寻找新型药物载体成为需要研究的问题。

β-环糊精聚合物微球(β-CDP)是β-环糊精(β-CD)经高分子化后的一种衍生物，既保持了β-CD包合、缓释及催化能力，又通过对其结构进行高分子化提高了其抗酸、抗碱和抗酶性等，在体内也有较好的变形性和生物相容性，作为药物载体可有效提高药物稳定性和生物利用度[5-7]。目前已制备的β-CDP在结构上、机械强度上的不足使得载药微球的制备在稳定性等方面还需不断进行改进研究[8]。探讨制备稳定性更好，载药性、释药性能更强的载药聚合物微球，对发挥其在现代药物制剂技术中的更大的作用，以及扩大其在其他应用领域的应用都有着重要的意义。

以β-CD为原料，环氧氯丙烷(ECH)为交联剂，反相乳液聚合制备β-CDP，以盐酸环丙沙星为模型药物，共沉淀法得到载药环糊精聚合物微球(Cip-β-CDP)，以最佳w(溶媒)、投料比m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)、反应时间、反应温度为单因素，以包封率、载药率、结合综合评分考察制备Cip-β-CDP的条件，并初步考察其缓释性能。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

β-CD：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸环丙沙星：纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司；ECH、Span80、Tween20：化学纯，天津市光复精细化工研究所；醋酸、丙酮、乙醇、盐酸、氢氧化钠：分析纯，市售；煤油：市售；实验用水为蒸馏水，自制。

1.2 实验方法

1.2.1β-CDP的制备[9]

取β-CD 10 g，溶于w(氢氧化钠)=40%溶液中，加入ECH 14.68 g，搅拌1.5 h后，再加入1.6 g复配乳化剂[m(Span80)：m(Tween20)=3∶1]于80 mL煤油中。搅拌10 min后，升温至70 ℃，反应6 h。离心分离，以质量分数为5%的盐酸、乙醇、丙酮、蒸馏水依次洗涤2～3次，离心，冷冻干燥。

1.2.2 Cip-β-CDP的制备

采用共沉淀法制备Cip-β-CDP：取一定量的β-CDP，蒸馏水溶解至饱和溶液，再称取一定量的盐酸环丙沙星，用少量一定质量分数的醋酸稀溶液溶解，将盐酸环丙沙星醋酸溶液加入β-CDP饱和溶液中，磁力搅拌控制反应温度和反应时间，结束反应后冷藏24 h使包合物析出，抽滤，产物以丙酮、乙醇、盐酸充分洗涤，离心，冷冻干燥保存，收集上述滤液，测吸光度。

1.2.3 评价指标

(1)最大吸收波长的确定

分别取盐酸环丙沙星、盐酸环丙沙星与空白β-CDP的物理混合物超声溶解于w(醋酸)=1%溶液中，过滤，收集滤液在200～400 nm波长范围内进行紫外扫描，观察最大吸收峰出现位置及紫外吸收情况。

(2)载药率和包封率的计算

Y1=m(载药微球中药物)/m(载药微球)×100%

(1)

Y2=m(载药微球中药物)/m(加入药物)×100%

(2)

1.2.4 单因素实验

根据预实验及前期工作，选择投料比m(β-CDP)：m(盐酸环丙沙星)、包合时间、包合温度以及溶媒w(醋酸)为单因素考察项目，按1.2.2方法，分别进行单因素实验。

1.2.5 Cip-β-CDP释药性能考察

按照中国药典2020年版[11]，用动态透析法考察冷冻干燥制备的Cip-β-CDP载药微球的累积释放率。取0.125 3 g Cip-β-CDP于处理好的透析袋中，置于40 mL、(37±5)℃磷酸缓冲液PBS(pH=6.8)中，磁力搅拌进行溶出。Cip-β-CDP分别于第0.5、1、4、8、24、48和72 h对应时间点取样4 mL，同时补充等体积同温度的PBS缓冲液，最大吸收波长处测定吸光度，计算累积释药量，绘制累计曲线图。

1.2.6 Cip-β-CDP的红外光谱

分别取少量盐酸环丙沙星、空白β-CDP、Cip-β-CDP，盐酸环丙沙星和β-CDP物理混合物，将其与溴化钾充分研磨后压片，测其红外光谱。

2 结果与讨论

2.1 制备得到空白β-CDP的显微镜观察

β-CDP光学显微镜图见图1。

a 交联剂滴加速度较快

b 交联剂滴加速度较慢图1 β-CDP光学显微镜图

图1a为在前期工作基础上调整加快交联剂滴加速度进一步优化β-CDP制备方案得到的β-CDP空白微球，可以看出所得微球数量多、大小均一。图1b是在制备过程中降低搅拌速度和交联剂添加量后所制备出的微球。与图1a相较，粒径不均一分散性不好，可见搅拌速度对聚合物微球的均一性、分散性有一定的影响。

2.2 盐酸环丙沙星最大吸收波长的确定

盐酸环丙沙星的紫外最大吸收峰见图2。

λ/nm 图2 盐酸环丙沙星的紫外吸收曲线

实验选择最大波长为277 nm处为紫外吸收测定波长。由图2可知，a、b均在277 nm处有最大吸收峰，空白微球对Cip最大吸收峰无干扰。

2.3 红外光谱分析

盐酸环丙沙星、盐酸环丙沙星和β-CDP物理混合、Cip-β-CDP、β-CDP的红外光谱曲线见图3。

由图3可知，盐酸环丙沙星曲线中1 625 cm-1处的吸收峰为芳香环吸收峰，1 710 cm-1处的强吸收峰为羰基特征峰。根据冷冻干燥空白微球与盐酸环丙沙星的物理混合物的红外谱图可知，1 625 cm-1处的吸收峰为盐酸环丙沙星芳香环吸收峰，1 710 cm-1处的强吸收峰为盐酸环丙沙星结构中羰基特征峰，3 514 cm-1为盐酸环丙沙星与冷冻干燥空白微球中的—OH峰在此处的叠加。根据冷冻干燥Cip-β-CDP的红外谱图可知，冷冻干燥空白微球在载药盐酸环丙沙星后并没有表现出Cip的特征峰，说明盐酸环丙沙星和烘箱干燥空白微球并不是简单的物理混合。根据冷冻干燥空白CDP微球的红外谱可知，3 429 cm-1处有明显的峰，峰的强度大且为钝峰，故判断该峰可能是—OH峰，为β-CDP特征峰。

2.4 盐酸环丙沙星标准曲线的制备

称10.10 mg盐酸环丙沙星标准品，转移至50 mL容量瓶内，用w(醋酸)=1%溶液将药物溶解，定容。精确吸取标准品溶液各0.6、0.8、1.0、0.8、1.2、1.4和1.6 mL溶液至25 mL容量瓶中，用w(醋酸)=1%溶液定容到25 mL。w(醋酸)=1%溶液作为空白，277 nm处测定上述溶液的吸光度，得到标准曲线回归方程y=108.06x+0.024 1，R2=0.998 9。

2.5 单因素实验

2.5.1w(醋酸)的影响

按1.2.2方法，平行取4组投料比m(盐酸环丙沙星)：m(β-CDP)=0.3，编号。分别用w(醋酸)=0.25%、0.5%、1%、2%溶液溶解盐酸环丙沙星，另取β-CDP加蒸馏水制成饱和水溶液，在一定转速下，分别缓慢滴加不同w(醋酸)溶解的盐酸环丙沙星至饱和β-CDP溶液中，50 ℃下分别反应3 h。结束反应后，冷藏24 h，抽滤，取上清液测吸光度，以1.2.3中包封率、载药率和综合评分指标计算不同w(醋酸)对Cip-β-CDP载药率、包封率影响。w(醋酸)对Cip-β-CDP的影响见图4、图5。

w(醋酸)/%图4 w(醋酸)对Cip-β-CDP的影响

w(醋酸)/%图5 综合评分

由图4可知，包封率随着w(醋酸)的增加先增加后趋降低，根据综合评分公式Y=396.405Y1+103.063Y2-20.27；由图5可知，w(醋酸)=1%时，综合评分值最大，说明w(醋酸)=1%溶液为较合适的溶媒。

2.5.2m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)的影响

按1.2.2方法，分别以m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)=0.05、0.10、0.15、0.20、0.30，以w(醋酸)=1%溶液溶解盐酸环丙沙星，缓慢滴加至β-CDP饱和水溶液中，50 ℃的条件下反应3 h。洗涤，抽滤，取上清液测吸光度，计算在不同m(盐酸环丙沙星)：m(β-CDP)下Cip-β-CDP的载药率和包封率。m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)对Cip-β-CDP的影响见图6、图7。

m(盐酸环丙沙星)：m(β-CDP)图6 m(盐酸环丙沙星)：m(β-CDP)对Cip-β-CDP的影响

m(盐酸环丙沙星)：m(β-CDP)图7 综合评分

由图6、图7可知，包封率随着m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)的增大呈现先升高后逐渐降低，载药率也随着m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)的增大呈现先升高后略有减低，根据综合评分公式Y=424.788Y1+471.797Y2-48.349，结合图7可知，当m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)=0.15综合评分值最大，选择该投料比较好。开始阶段包封率载药率上升速度快，当m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)接近合适比例，再增加β-CDP或者药物的量，包封率不再增加，推测其可能原因是包合反应进行时，盐酸环丙沙星分子进入β-CDP的空穴中，β-CDP和客体分子盐酸环丙沙星之间需保持最佳的比例，当m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)=0.15，药物分子基本上已经被包合完全。

2.5.3 反应时间的考察

按1.2.2方法，以m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)=0.15，用w(醋酸)=1%溶液溶解盐酸环丙沙星，缓慢滴加至β-CD饱和水溶液中，在50 ℃的条件下分别反应3、4、5和6 h，洗涤，抽滤，取上清液测吸光度，计算在不同反应时间下Cip-β-CDP载药率和包封率。反应时间对Cip-β-CDP的影响见图8、图9。

t/h图8 反应时间对Cip-β-CDP的影响

t/h图9 综合评分

由图8可知，包封率、载药率随着反应时间的增加开始逐渐升高然后有所降低。分析原因可能因为包合物分子多以分子间作用力结合，这种结合力较弱，当大多数盐酸环丙沙星分子已经被包合，继续增加搅拌时间可能会破坏药物和环糊精包合物分子间的作用力，使已经包合的包合物分子发生离解，降低包合率和载药率。根据综合评分Y=396.161Y1+297.432Y2-66.04，结合图9可知，反应时间为5 h，综合评分值最大，说明5 h为合适的反应时间。

2.5.4 反应温度的考察

按1.2.2方法，m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)=0.15，w(醋酸)=1%溶液溶解盐酸环丙沙星，缓慢滴加至β-CD饱和水溶液中，分别在40、50、60、70和80 ℃反应5 h，洗涤，抽滤，取上清液测吸光度，计算在不同温度下Cip-β-CDP的载药率和包封率。反应温度对Cip-β-CDP的影响见图10、图11。

t/℃图10 反应温度对Cip-β-CDP的影响

t/℃图11 综合评分

由图10可知，包封率和载药率均随着反应温度的升高呈现先增加后降低的趋势。升高温度可以加快包合反应的速度，但温度超过80 ℃，盐酸环丙沙星分子可能会不稳定，故包合反应时温度一般低于60 ℃。根据综合评分Y=190.859Y1+46.427Y2-5.759，结合图11可知，在60 ℃时综合评分值最大，说明60 ℃为较好的反应温度。

在以上单因素条件下，即以w(醋酸)=1%溶液为溶媒，m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)=0.15，反应温度60 ℃，反应5 h，该条件下重复制得Cip-β-CDP的显微镜下成型较好，平均载药率为8.96%，包封率为48.77%。

2.6 载药微球的释药性能和动力学方程

冷冻干燥的Cip-β-CDP在37 ℃下磷酸盐缓冲液(PBS，pH=6.8)中的体外缓释累积曲线见图12。

t/h图12 Cip-β-CDP在37 ℃下PBS(pH=6.8)中的体外释药累积曲线

由图12可知，Cip-β-CDP在PBS(pH=6.8)中，前4h释放速率较大，稍后略有放缓，但持续增大，整个过程呈持续释放的趋势。72 h后累积释药量为74.5%。

为了解盐酸环丙沙星的释药过程，将上述数据分别用零级(Mt/M∞=kt)，一级(Mt/M∞=1-e-kt)，Higuchi(Mt/M∞=kt0.5)，Ritger-Peppas(Mt/M∞=ktn)模型方程拟合，所得释药累积曲线见图12，回归方程见图13，a为零级模型方程拟合，b为一级模型方程拟合，c为Higuchi模型方程拟合，d为Ritger-Peppas模型方程拟合。体外累积释药曲线拟合结果见表1。

t/h图13 Cip-β-CDP释药拟合方程

表1 Cip-β-CDP的体外累积释药曲线拟合结果

由表1可知，Cip-β-CDP释放符合Ritger-Peppas动力学，有较好的拟合结果，n<0.45，说明药物的释放机制为Fick扩散。

3 结 论

由反相乳液聚合冷冻干燥制备得到β-CDP，共沉淀法得到Cip-β-CDP，在光学显微镜下观察微球的形态，外表圆润均匀，数目多。红外图谱表明盐酸环丙沙星被β-CDP包载。通过单因素实验考察得到m(盐酸环丙沙星)∶m(β-CDP)=0.15，温度为60 ℃，反应5h，制得的Cip-β-CDP具有较好的载药率，载药率为8.96%，包封率为48.77%；缓释性实验表明，药物在37 ℃PBS(pH=6.8)中缓慢释放，Cip-β-CDP体外释药符合Ritger-Peppas释药方程，释药机制为Fick扩散。