乳寡糖调控新生仔猪肠道健康的研究进展

■吴秋杰 李 勇 卓 勇 吴 德

（1.四川农业大学动物营养研究所，四川成都 611130；2.广西商大科技股份有限公司，广西种猪营养工程技术研究中心，广西南宁 530105）

肠道疾病是引起新生仔猪发病和死亡的最主要原因[1]，关注早期肠道健康对提高仔猪存活率和后续生产性能具有重要意义[2]。新生仔猪肠道面临多重挑战[3]：首先是宫内发育时以胎盘转运养分为主，新生期以乳汁为营养来源，乳质量不佳直接导致肠道发育受阻；其次，从宫内发育到宫外发育的转换打破原有菌群环境，肠道菌落多样性面临重塑，而乳成分与质量是影响肠道微生物菌群平衡的重要外因之一；此外，由乳汁向固体饲料的转换也对仔猪肠道健康带来挑战。因此，促进肠道快速发育，改善有益微生物在肠道内的定植是提升新生仔猪健康水平的关键。

母乳作为新生期仔猪主要营养来源，其营养组成是设计新生期营养的黄金标准[4]。乳糖、乳脂、乳蛋白是被熟知的宏量营养素，其主要作为能量、蛋白来源发挥重要营养功能。乳寡糖（Milk oligosaccharides,MO）在乳中含量仅次于乳糖、乳脂、乳蛋白[5]。但作为一种低聚糖，乳寡糖在胃肠道中能够抵抗内源酶消化，大部分在后肠被微生物消化和代谢，是影响肠道微生物多样性的重要因素，且乳寡糖作为一种重要的生物活性分子在保障新生动物的健康中发挥着特殊功能[6-7]。因此，本文从乳寡糖的结构特点出发，综述乳寡糖影响新生仔猪肠道健康的主要途径及在新生仔猪日粮中的应用。

1 乳寡糖的特点

1.1 化学结构

乳寡糖是一种源于母乳的功能性低聚糖。主要由6 种基本单元通过糖苷键键合组成。D-葡萄糖（Glc）、D-半乳糖（Gal）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）组成乳寡糖的核心结构，另外的三个基团[L-岩藻糖（Fuc）、N-乙酰神经氨酸（NeuAc，又称唾液酸）、N-羟乙酰神经氨酸（NeuGc）]通过不同类型的糖苷键与核心结构的非还原端连接，形成中性乳寡糖和酸性乳寡糖两种类型[7-9]。研究发现，中性乳寡糖主要以岩藻糖基化乳寡糖为代表，酸性乳寡糖主要以唾液酸化乳寡糖为代表，在动物肠道健康中发挥着重要且不同的调节功能[7，10]。

通过化学结构的比较可以发现乳寡糖具有结构上的特殊性，常见的功能性寡糖如低聚果糖、低聚木糖、甘露寡糖等通常只含有β-1,2 糖苷键，β-1,4 糖苷键，组成单体为普通单糖[11]，而乳寡糖在此基础上，有额外的修饰基团以及不同的糖苷键，如唾液酸基团及对应的α-2，3，α-2，6糖苷键，岩藻糖基团及对应的α-1，2，α-1，3 糖苷键[12-13]。结构决定功能，乳寡糖所具有的特殊糖苷键以及特殊的修饰基团，赋予乳寡糖不同于植物性寡糖、酵母寡糖的特殊功能[14]。

1.2 乳寡糖的分泌规律

质谱是检测寡糖含量的主要方法[15-16]，经检测发现，品种、血型、生理阶段的差异都影响着母乳中乳寡糖的含量及多样性。人乳中的乳寡糖含量最多，种类最丰富，其初乳中含量为20～23 g/L，成熟乳中含量为7～12 g/L[4]。猪乳中，初乳中寡糖含量为11.85～12.19 g/L，常乳中含量为6.82～6.98 g/L[12]。分析不同阶段母猪乳汁中寡糖含量及类型，发现乳寡糖的含量及多样性随着泌乳阶段的进行而显著下降[17-18]。初乳中寡糖含量多达55 种，主要为唾液酸化乳寡糖（占55%～80%）和中性乳寡糖（占18%～33%），其中岩藻糖基化乳寡糖占比0.89%，此外还有其他类型的寡糖[17]。同时，3’-岩藻糖基乳糖含量随泌乳进行而增加，而2’-岩藻糖基乳糖含量逐渐下降[18]。新生仔猪肠道发育特点之一在于出生后数天内迅速发育[19]。研究表明仔猪摄入初乳24 h 后小肠发育及其消化、水解、转运营养物质的能力均显著提高[20-21]。结合乳寡糖在泌乳前期分泌更多的规律，暗示乳寡糖可能在新生仔猪肠道的早期生长发育中发挥了功能作用。Charbon⁃neau 等[22]分析比较了马拉维地区营养不良婴儿和健康婴儿母乳的成分差异，结果发现健康组母乳的乳寡糖总含量显著高于营养不良组；其中，岩藻糖基化乳寡糖和唾液酸化乳寡糖的含量不足是导致新生儿肠道发育受阻的重要原因。

2 乳寡糖改善新生仔猪肠道健康的作用途径

大量研究表明，乳寡糖影响肠道健康的可能途径主要有3 个方面：作为“诱饵”抵抗病原体的感染；作为信号分子调控肠道成熟；作为益生元调节肠道微生物菌群平衡。

2.1 作为“诱饵”抵抗病原体的感染

与肠上皮细胞受体特异性结合是病原体感染肠道的第一步，而病原受体的化学本质是特异性聚糖，MO 与特异性聚糖结构的相似性，使MO 作为病原体特异性受体类似物，竞争性地抑制病原体与肠上皮黏附，从而保护新生动物免于腹泻，这种结构的相似性往往体现在α-1,2糖苷键连接的岩藻糖基团和唾液酸基团[23-25]。Li 等[26]的试验中，新生仔猪感染轮状病毒（RV）后，配方乳、人乳寡糖、半乳寡糖果寡糖混合物虽未对轮状病毒产生预防作用，但乳寡糖的添加降低了仔猪腹泻的持续时间。Hester等[27]采用一种急性轮状病毒感染仔猪，通过测定轮状病毒复制标志物黏膜非结构蛋白-4（NSP4）的mRNA 表达，发现乳寡糖降低了轮状病毒在回肠中的复制。其中，不同种类的酸性乳寡糖都有上述抑制效应，中性乳寡糖只有乳-N-新四糖（LNnT）有类似抑制效果，说明不同类型的乳寡糖影响轮状病毒的能力不同，决定其“抗病毒”特性的关键在于它们不同的修饰基团。同样能够对轮状病毒产生抑制作用的还有一种物质叫作凝集素，在它的结构中含有和酸性乳寡糖相似的唾液酸基团。Newburg等[28]将乳凝集素去唾液酸化，结果发现，凝集素失去唾液酸基团后对轮状病毒的抑制作用完全丧失，这说明凝集素抵抗轮状病毒的效应在于唾液酸基团的存在。Hester等[27]在体外轮状病毒感染细胞模型的试验中验证了该观点，用猪的OSU株轮状病毒感染MA-104 细胞，结果发现含唾液酸（SA）的人乳寡糖（Human milk oligosaccharide, HMO）呈计量效应的抑制轮状病毒与宿主细胞的感染和结合，而中性HMO并没有这种抑制效应。

基于唾液酸基团抵抗轮状病毒的感染原理，岩藻糖基团同样能够特异性地抵抗病原菌的感染。研究发现，母乳中含有α-1,2 岩藻糖结构的乳寡糖浓度越高，婴儿腹泻的比例越低，两者之间呈现出一种负相关关系[29-30]。日粮添加2’-岩藻糖基乳糖增强新生仔猪感染轮状病毒后的免疫水平，其机制与2’-岩藻糖基乳糖减少病毒黏附，促进免疫系统发育有关[31]。在轮状病毒感染的大鼠模型上的研究也观察到类似的调控效应[32]。弯曲杆菌是引发新生儿腹泻的一种致病性病原菌，其致病性的第一步在于黏附肠黏膜。Ruizpalacios等[33]研究表明，弯曲杆菌黏附肠黏膜取决于上皮细胞表面的岩藻糖基α-1，2表位配体，体外试验结果发现，含有α-1，2 岩藻糖基的乳寡糖可以抑制弯曲杆菌对肠黏膜的附着，体内试验结果显示，该结构的乳寡糖可抑制弯曲杆菌在肠道的定植。这些证据表明岩藻糖基化的结构充当了可溶性配体，其与肠上皮细胞表面受体竞争结合弯曲杆菌和靶向α-1，2 配体的其他病原体，从而抵抗该类病原体对新生动物肠道的感染。

2.2 作为信号分子调控肠道成熟

肠道成熟与肠上皮细胞的增殖和分化有关。在肠道远端，乳寡糖被消化，而在近端肠道，未消化的乳寡糖作为信号分子可直接影响肠道上皮细胞。Kuntz等[34]用各种混合型乳寡糖和单一乳寡糖去培养3种不同谱系的肠道上皮细胞（HT-29、Caco-2、HIEC），研究发现酸性混合乳寡糖对3 种肠上皮细胞的生长都有剂量依赖性的抑制作用，单一寡糖中所有的酸性寡糖都抑制HT-29细胞的增殖。同时，该研究者检测了不同乳寡糖对肠上皮细胞分化的影响，结果发现，在混合寡糖中，酸性乳寡糖对HT-29 和HIEC 细胞的分化有显著的诱导作用。在单一寡糖类型中，只有唾液酸乳寡糖具有诱导HT-29 和HIEC 细胞分化的作用，表明乳寡糖既是肠细胞的增殖抑制剂，又是分化诱导剂。研究者探讨了乳寡糖抑制肠上皮增殖的分子机制[34]，通过流式分析发现中性酸性乳寡糖均能剂量依赖性地诱导细胞G2/M 期阻滞。G2/M 期为细胞复制后期，该时期占比越大，S 期（DNA 复制期）占比就越小，从而抑制细胞分裂。通过测定调节细胞周期关键蛋白的mRNA 水平，乳寡糖引起的G2/M 细胞周期停滞是通过EGFR 信号通路和细胞周期相关基因表达来诱导肠细胞生长停滞，其机制涉及EGFR 磷酸化、p38 激酶磷酸化，从而激活细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21cip1的活性而产生G2/M细胞周期停滞[35]。

Perdijk 等[36]运用基因芯片技术和IPA 鉴定，结果显示SL（唾液酸乳寡糖）调节了Caco-2小肠上皮细胞的细胞周期进程和有丝分裂通路。为了研究这些转录效应是否可转化为细胞周期进展和细胞增殖的表型，在含有唾液酸乳寡糖（SL）的完全培养基中下培养Caco-2细胞4 d，使用流式细胞术评估细胞数和活细胞比例，结果显示，在高浓度SL 情况下，细胞数量减少，上皮细胞分化标志物（碱性磷酸酶活性）增加，说明唾液酸乳寡糖抑制了细胞增殖，并诱导了细胞分化。这些结果显示乳寡糖作为一种信号因子调节细胞增殖和细胞分化之间的平衡。

2.3 作为益生元调控肠道微生物菌群平衡

乳寡糖在前肠抵抗内源酶消化，在后肠可作为益生元调控肠道微生物的菌群平衡。Perdijk 等[36]在体外试验中发现，唾液酸乳寡糖促进了双歧杆菌和拟杆菌的生长。众所周知，双歧杆菌是一种有益的肠道微生物，拟杆菌是共生菌，二者是新生动物肠道菌群中的优势菌。发表于Cell 杂志的报道也证明纯化的唾液酸化牛乳寡糖主要由脆弱拟杆菌代谢[22]，脆弱拟杆菌还能产生多糖A 诱导CD4+T 细胞分化成肠道中的调节性T细胞，从而促进免疫稳态[37]，在早期生命中免疫系统发育中扮演着重要的角色。Rudloff 等[38]在研究早产猪的乳寡糖代谢试验中发现，仔猪结肠内容物中，双歧杆菌的丰度和乳寡糖浓度呈负相关，且单一乳寡糖2’-FL 与双歧杆菌的丰度呈现更强的负相关关系，表明乳寡糖调节了双歧杆菌在后肠的生长和定植。Li等[26]在新生仔猪的研究中发现，饲喂人源乳寡糖的仔猪的微生物菌群与配方乳组和益生元组的微生物群都不同，人乳寡糖组仔猪的结肠内容物中未分类的Lachnospiraceae（毛螺菌科）的数量显著增加。毛螺菌科分离株在无菌小鼠中能抑制艰难梭菌的定植[39]，临床研究也表明毛螺菌科丰度降低与慢性肠道疾病（如炎症性肠病）相关[40]，且毛螺菌科含有大量的丁酸盐产生菌，从而可以发酵乳寡糖产生对肠道形态和屏障功能有益的短链脂肪酸[41]。上述研究结果都表明，乳寡糖可通过影响新生期仔猪的肠道微生物菌群平衡调节免疫系统发育，维护机体健康。

3 乳寡糖在新生仔猪日粮中的应用

乳寡糖对新生仔猪健康的调控效应正处于研究热点和前沿，但乳寡糖对仔猪肠道健康的影响尚存在争议。Charbonneau 等[22]给无菌仔猪定植了营养不良婴儿的肠道微生物，在基础饮食中添加唾液酸化乳寡糖，结果发现唾液酸化乳寡糖极显著提高了新生仔猪的体增重。在此基础上再引入有害菌大肠杆菌的定植，结果显示乳寡糖仍然极显著地提高了仔猪的体增重，从而引起营养学家的广泛关注。研究考察了牛乳寡糖对早产仔猪生长性能以及肠道微生物的影响[42]，结果发现在基础饮食中添加唾液酸乳寡糖对早产仔猪的生长性能以及结肠微生物多样性没有显著影响。进一步比较了剖腹产人工喂养与自然分娩哺乳的仔猪肠道发育，结果发现自然分娩哺乳的仔猪肠道刷状缘酶和肠道微生物发酵产物显著高于剖腹产人工喂养的仔猪，该结果说明分娩方式以及人工饲养条件可能掩盖了乳寡糖对肠道健康的潜在作用，且试验中仔猪进行了口服抗生素处理，这也可能影响了肠道微生物的组成[43]。与此同时，在猪乳中，3’-SL、6’-SL寡糖为优势乳寡糖，该研究添加的乳寡糖混合物只含有4.5%的3’-SL、6’-SL，且牛乳中SL 以Neu5Gc 为代表，而Neu5Gc在猪乳中几乎不存在[8，12，44]。猪乳优势乳寡糖3’-SL、6’-SL并不是试验中混合乳寡糖主要的SL，也可能导致乳寡糖对仔猪肠道健康的影响没有达到显著差异。Cilieborg等[45]研究了岩藻糖基乳寡糖对大肠杆菌攻毒的新生仔猪的影响，研究发现岩藻糖基乳寡糖对大肠杆菌攻毒导致的腹泻没有缓解作用，但有降低大肠杆菌攻毒导致的失重的趋势。该试验还研究了大肠杆菌攻毒后岩藻糖基乳寡糖对新生仔猪小肠绒毛和刷状缘酶活性的影响，结果发现添加2’-FL的仔猪肠绒毛显著高于未添加2’-FL 的仔猪。此试验处理时间只有8 d，处理时间过短以及大肠杆菌攻毒浓度过高可能是2’-FL 没有对肠道产生明显积极效果的原因[36]。同时，当前大多研究主要以猪为模型研究乳寡糖对新生动物肠道健康的影响，其处理剂量、饲喂环境、营养干预方式与实际生产有一定差异，导致乳寡糖在仔猪上的饲喂效果存在差异，因而需要更多的生产试验研究乳寡糖对新生仔猪肠道健康的影响。

4 总结与展望

乳寡糖是新生哺乳动物重要的功能性低聚糖，其特定的结构赋予其特殊的生理功能，不同模型的试验已经证明乳寡糖对新生动物肠道健康的积极效果。根据特殊乳寡糖可作为病原体特异性受体类似物，竞争性地抑制病原体与肠上皮黏附的特性，可以开发由黏膜病原体引起的肠道疾病的新型预防和治疗剂，从而代替抗生素的使用。生产中已经开始以乳寡糖为重要手段研发仔猪的抗病营养技术[46]，对于禁抗背景下，提高新生健康水平及存活率具有重要作用。

但目前有关乳寡糖在生产中的应用尚存亟待研究的问题，如目前尚缺乏混合型乳寡糖最佳比例的研究，且现有的研究大多采用的是体外模型，还需要使用更多体内试验研究乳寡糖、微生物群、宿主之间的复杂相互作用。