1株致放化疗患者口腔感染霍乱弧菌的鉴定和病原特征分析*

解鸿翔，曹文静，谢姝惠，郭建壮，李晓凤，吕士玉，马建萍，刘翠萍(1.浙江省人民医院 杭州医学院附属人民医院检验中心，杭州10014；2.山东第一医科大学第一附属医院 a.检验医学科，b.保健综合科，济南 250014；.台州学院医学院，浙江台州 18000)

霍乱弧菌(Vibriocholerae)是一种致病性的革兰阴性杆菌，广泛存在于地表的各类水域生态系统。根据菌体表面O抗原可将霍乱弧菌分为200多个血清群，其中只有O1和O139群可以引起霍乱的暴发或流行[1]。非O1/O139群霍乱弧菌(non-O1/non-O139Vibriocholerae，NOVC)是除O1群和O139群以外血清群的总称，常引起轻到中度的胃肠炎、菌血症、中耳炎和伤口感染等[2]。虽然在形态和生化反应上与O1群和O139群霍乱弧菌没有区别，但NOVC菌株一般缺乏产毒性霍乱弧菌的几个主要的毒力因子，如霍乱毒素(cholera toxin，CTX)和毒素共调节菌毛(toxin coregulated pilus，TCP)，其致病性与其他毒力因子有关，包括溶血素(hemolytic cytolytic A，hlyA)、血凝素蛋白酶(hemagglutinin protease，hap)、热稳定肠毒素(heat stable enterotoxin，ST)、RTX毒素(repeat-like toxin，rtx)、6型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)等[3]。近年来，NOVC引起肠道外侵袭性感染的报道逐渐增多[3-4]，但口腔感染NOVC的病例仍然非常罕见。本研究鉴定了1株导致食管癌术后放化疗患者口腔感染的NOVC，并对其病原生物学特征进行分析。

1 材料与方法

1.1病历资料及菌株来源 患者男，51岁，因“发现血小板减少10余天”于2019年10月8日就诊山东第一医科大学第一附属医院。患者述平日喜食鱼虾，10余天前因进食海虾后出现发热(体温高达38.5 ℃)、腹痛、腹泻而就诊于当地医院。当时腹泻1 d,10余次,水样便，并很快于口唇及脸颊内侧出现多发血泡，易破溃，上下唇内侧黏膜和上腭黏膜广泛糜烂，融合成片状并上覆伪膜，舌底出现较大溃疡面，疼痛明显，影响进食。当地医院给予抗感染、止泻、升白细胞及升血小板等治疗，患者体温正常，腹泻好转，但血小板始终未有升高，为求进一步诊疗入住我院。既往“食道癌术后”，已行化疗12次，放疗27次。患者入院时体温36.8 ℃，生命体征平稳；口唇可见血泡，口腔内可见片状白斑，舌底可见溃疡；双肺叩诊呈清音，听诊双肺呼吸音粗；上腹部可见一条10 cm左右纵形疤痕，双下肢轻度水肿，余查体未见明显异常。患者入院后出现反复发热，胸部CT提示双肺炎症，实验室检查：WBC 3.34×109/L，Neu 2.71×109/L，RBC 2.03×1012/L，Hb 75.0 g/L，PLT 13×109/L，清蛋白34.80 g/L，C反应蛋白25 mg/L，降钙素原0.156 ng/mL，曲霉菌抗原检测、真菌G试验、血培养均阴性，大便常规、大便培养、尿常规、肝功能生化指标、肾功能生化指标、电解质等未见明显异常。留取患者口腔拭子进行细菌培养，结果回报NOVC生长。给予头孢哌酮/舒巴坦控制感染及预防出血、纠正贫血、刺激骨髓造血等对症支持治疗，患者体温降至正常，口腔感染症状明显好转。

1.2主要仪器与试剂 全自动基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析仪及配套试剂(德国布鲁克公司)，Qubit 2.0荧光计(美国赛默飞世尔公司)，NovaSeq PE150测序仪(美国Illumina公司)；血琼脂平板和弧菌选择性培养基(TCBS，济南百博公司)，O1、O139群霍乱弧菌诊断血清(宁波天润公司)，药敏纸片(英国Oxoid公司)，SDS(国药试剂有限公司)，Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina试剂盒(美国NEB公司)。

1.3细菌分离培养 取患者上下唇内侧黏膜和上腭黏膜糜烂处分泌物接种于血琼脂平板中，置35 ℃、5% CO2培养箱内培养，48 h后取菌落涂片进行革兰染色镜检。

1.4MALDI-TOF MS鉴定 用接种环取少量血琼脂平板上生长的单个菌落均匀涂布于MALDI靶板，自然干燥；加入1 μL基质液，待自然干燥后放入质谱仪进行检测。根据待测菌图谱与数据库中特征主峰谱的对比情况进行鉴定，并用分数表示：分值2.300～3.000表示完全可靠的鉴定到种水平，2.000～2.299表示鉴定到种水平，1.700～1.999表示鉴定到属水平，0.000～1.699表示没有可靠的鉴定结果。

1.5血清群鉴定 血平板上取适量单个菌落，分别与O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清充分涂匀，进行玻片凝集试验，以生理盐水作阴性对照。

1.6药物敏感试验 根据2016年美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)发布的M45文件中对霍乱弧菌的药敏试验要求进行K-B法药敏试验。

1.7基因组分析 用SDS法提取样本基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性，用Qubit荧光计进行定量[5]。检测合格的DNA样品进行文库制备、Illumina NovaSeq PE150测序。对原始测序数据(Raw Data)进行过滤处理，去除包含Adapter的序列及低质量数据。将得到有效数据(Clean Data)使用SOAP denovo[6]、SPAdes[7]、ABySS[8]组装软件进行组装，并最终使用CISA[9]软件进行整合；用gapclose(Version：1.12)等软件对初步组装结果进行优化和补洞，从而得到最终组装结果。具体测序和组装过程由北京诺禾致源公司完成。将原始测序数据比对到组装好的基因组序列上，通过统计组装序列的GC含量和测序深度，总结基因组的GC偏向性和重复序列情况。分别将组装好的序列上传至核糖体多位点序列分型(ribosomal multilocus sequence typing，rMLST)数据库(https://pubmlst.org/species-id)及JspeciesWS数据库(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws)，进行菌种识别和平均核苷酸相似度(average nucleotide identity，ANI)分析。用GeneMarkS软件进行编码基因预测及过滤，使用Diamond软件将目标物种的氨基酸序列与非冗余蛋白质数据库(Non-Redundant Protein Database，NR)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)注释进行比对，可进一步得到物种信息[10]。

1.8毒力基因分析 用Diamond软件，将目标物种的氨基酸序列分别与VFDB数据库[11](Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，http://www.mgc.ac.cn/VFs)和PHI数据库[12](Pathogen-Host Interactions databas，http://www.phi-base.org)进行比对，将目标物种的基因和其相对应的毒力因子功能注释信息结合起来，得到毒力基因注释结果。

1.9多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST) 将组装好的测序文件与PubMLST数据库(http://pubmlst.org/vcholerae/)中相应的7个管家基因adk、gyrB、mdh、metE、pntA、purM、pyrC进行序列比对，从而确定其序列型(sequence type，ST)。根据该菌株的ST，用PubMLST数据库对该菌株最小生成树进行分析。

2 结果

2.1细菌形态特征 口腔拭子接种于血琼脂平板经35 ℃培养18～24 h后见可疑菌落生长。取该菌落涂片革兰染色，镜下显示革兰阴性微弯曲的杆菌(图1A)。该菌落转种于血琼脂平板和TCBS培养基培养48 h后，该菌在2种培养基中均生长良好，血琼脂平板上菌落较大，呈灰绿色、有β溶血环的湿润菌落(图1B)，在TCBS平板上呈黄色大而湿润的菌落(图1C)。

注：A，革兰染色；B，血琼脂平板；C，TCBS平板。

2.2质谱鉴定与血清群分型 菌株经MALDI-TOF MS鉴定为霍乱弧菌，鉴定分值为2.151。血清凝集试验结果显示，该菌与O1群、O139群霍乱弧菌诊断血清均未发生凝集反应，鉴定为NOVC。

2.3分子生物学鉴定 测序深度和覆盖度显示该样品平均测序深度213，覆盖度99.99%，测得DNA长度为4 018 291 bp，GC含量为44.93%。GC-Depth分析显示，该样品测序扩增时不存在明显的GC偏向，组装中无明显的错配及污染序列，见图2A。将组装好的序列上传至PubMLST网站的rMLST数据库进行菌种识别，结果显示上传序列与霍乱弧菌吻合度为100%。将序列上传至JspeciesWS数据库进行ANI分析，ANIb值为96.05%，ANIm值为96.56%。将测序序列用NR数据库进行基因注释，共得到霍乱弧菌相关的基因2 981个，见图2B。

注：A，GC-Depth分析；B，NR注释分析。

2.4药敏试验结果 该菌对哌拉西林中度敏感，对哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、头孢哌酮/舒巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南均敏感。

2.5毒力基因分析 基因组重测序结果显示，该菌株不存在ctxAB、tcpA、zonulaoccludenstoxin(zot)、accessorycholeraenterotoxin(ace)及st等毒力基因，毒素表达调控蛋白基因(toxinregulatorygene，toxR)、hlyA、唾液酸酶基因(neuraminidaseH，nanH)、hapA、甘露醇敏感血凝素(mannosesensitivehemagglutinationA，mshA)、外膜蛋白粘附因子(outermembraneproteinU，ompU)、rtxC以及T6SS等基因为阳性。

2.6MLST分型 该菌株7个管家基因在数据库内均能找到相对应的等位基因数值，分别为adk17、gyrB5、mdh51、metE31、pntA34、purM6、pyrC29，但未有对应的序列分型。将原始的测序结果及整理后的碱基序列提交PubMLST网站，得到新的ST型为ST-986，并进行最小生成树分析。见图3。

注：ST显示为圆圈，每个圆圈的大小表示此特定类型中分离株的数量；2个圆圈之间的线上的数字代表2种类型的不同数量。

3 讨论

该患者以腹泻、腹痛伴发热起病，并很快出现口腔感染症状。患者在当地医院经抗菌药物治疗后腹痛、腹泻好转，为继续治疗放化疗引起的继发性血小板减少入住我院。入院后口腔拭子细菌培养检出NOVC。研究表明，由NOVC引起的感染在免疫缺陷患者中更为常见，特别是肝硬化、糖尿病、血液系统疾病和恶性肿瘤患者[2]。本病例为食管癌术后放化疗患者，属NOVC高危易感人群。放化疗导致的骨髓抑制、免疫力低下和口腔黏膜损伤可能是患者口腔感染NOVC的重要原因。患者平日喜食鱼虾，考虑本病例中感染的NOVC可能来源于受污染的食物。

NOVC口腔感染虽然不会致命，但可引起患者口腔疼痛，影响进食，降低患者生活质量。研究表明，Bruker Biotyper MALDI-TOF MS系统具有准确识别致病性弧菌种类的能力[13]。本研究首先通过该技术快速地从物种水平鉴定为霍乱弧菌。rMLST是一种基于核糖体的多位点序列分型，可进行菌种识别[14]。ANI即平均核苷酸一致性，主要用于在全基因组水平评估物种间的亲缘关系，ANI值超过95%被视为界定种的标准[15]。NR数据库可以把目标物种的基因和其相对应的功能注释信息结合起来[10]。我们通过rMLST、ANI分析和NR比对，进一步从分子生物学角度证实该菌为霍乱弧菌。

在本研究中，该菌株对临床常用的抗菌药物均敏感，患者经过头孢哌酮/舒巴坦治疗恢复良好。该患者入院后的大便培养和血液培养中均未检出霍乱弧菌，可能与患者入院前经过了一段时间的抗菌药物治疗有关。同时，该患者在当地医院治疗时未行大便培养，因此错失了从大便中分离出霍乱弧菌的机会。国内Wu等[16]报道已有少数NOVC菌株携带编码超广谱内酰胺酶(ESBL)基因而对第三代头孢菌素耐药现象。印度和越南的研究显示，临床和环境中分离的NOVC菌株已经出现NDM-1金属酶介导的碳青霉烯酶抗性[17]。因此，根据药敏试验结果制定治疗方案仍然十分重要。

虽然本文检出菌株缺乏ctxAB、tcpA、zot、ace及st等主要毒力基因，但其含有可能编码其他辅助毒力因子的基因，如toxR、hlyA、nanH、hapA、mshA、ompU、rtxC以及T6SS等。这些毒力因子可能提高该菌株的致病性，并在感染过程中发挥协同作用。由于现有数据库毒力基因信息数量的局限，该菌株是否存在其他的毒力基因仍需进一步分析，每种已知的毒力基因在患者口腔感染中的具体机制仍需进一步研究。此外，我们还进一步通过MLST对该菌株进行研究，以确定其遗传异质性。MLST结果表明我们鉴定的NOVC为新的序列型(ST986)。该菌株与我国最为流行的ST80(adk2、gyrB5、mdh45、metE56、pntA6、purM36、pyrC51)有6个基因座差异，可引起散发感染。Luo等[18]报道ST80是我国浙江省腹泻患者粪便中分离的NOVC菌株优势克隆。在PubMLST数据库中，与该菌株最相似的ST是ST209(adk17、gyrB5、mdh51、metE31、pntA34、purM11、pyrC29)，该型首次在我国山东省发现，分离自胆汁标本；另有1株分离自痰培养标本的NOVC(ST210)，与本株进化上有较大差异。由此可见，NOVC的序列类型可能在我国具有明显的地域特征。

综上所述，本研究检出1株ST-986的新型非O1/O139群霍乱弧菌，揭示肿瘤化疗患者口腔感染该型NOVC的可能性，并提示一些辅助毒力因子可能在该菌株的致病性中起重要作用。虽然NOVC引起的口腔感染罕见，但临床医生应警惕免疫力低下患者感染这种病原体的可能性。